第六讲：绿色植物与光合作用

第二节 植物细胞信号转导

一、环境刺激与胞外信号

（一）环境刺激

（二）胞间化学信号

（三）胞间物理信号

二、跨膜信号转换：受体与G蛋白

（一）受体

（二）G蛋白（G proteins）

三 细胞内信号

（一）Ca²⁺信号系统

（二）肌醇磷脂信号系统

（三）环核苷酸信号系统

（四）蛋白质的可逆磷酸化

　　植物扎根于土壤之中，在其生命进程中它难以逃避或改变环境，因此只有通过不断调整自身的生理状态以适应多变的环境才能维持其生存。植物对环境适应调整的过程实际上就是植物体感受环境信号后作出相应生理反应的过程，这一过程的关键便是发生在植物体内外的信息转导过程。在植物信号转导的研究上，尽管近十多年来已取得许多重要进展，但总的来看，尤其是与动物相比，却仍处于幼年阶段。根据目前的研究结果，一般将生物细胞信号转导的分子途径划分为四个阶段，即：胞间信号、膜上信号转换机制、胞内信号以及以蛋白质可逆磷酸化为主的胞内信号传递。以下将按这四方面介绍近几年来植物细胞信号转导方面的一些研究进展。

Ip₃：三磷酸肌醇；DG：二脂酰甘油;PKA：依赖cAMP的蛋白激酶;PKAca²⁺：依赖ca²⁺的蛋白激酶；

PKC：依赖Ca²⁺与磷脂的蛋白激酶;PKCa²⁺CaM：依赖Ca²⁺.CaM的蛋白激海

　　一、环境刺激与胞外信号

　　（一）环境刺激

　　近年来，人们越来越注意到各种作用于植物体的环境刺激因子的信号转导问题。这些因子包括光、温度、重力、风、雨、触摸、伤害、病原激发子（elicitors）、水分、气体、矿质等。但是这些刺激因子所引起信号转导的完整分子途径大部仍不清楚。

　　植物对光刺激，特别是对以光敏素介导的红光一远红光可逆生理反应的研究，开始较早，亦较深入。Haupt与Weiseseel早在1976年就认为红光通过光敏素介导生理反应可能引起胞内ca²⁺水平增加，Roux则明确提出ca²⁺作为第二信使参与光敏素反应的假设（1984）。以后这方面的一些研究结果都支持这种观点，但也有不同意见，特别是对ca²⁺流的方向问题长期存在着争论。

　　Trewavas实验室的工作同样十分有力地说明环境刺激引起细胞信号传导。他们建立了水母发光蛋白转基因着茄植株用来测定细胞质内ca²⁺浓度，然后对幼苗进行触动，温度变化及真菌激发子（elicitors）处理。发现触摸及将处在20 ℃下的幼苗移至0℃或5℃低温条件下，细胞质内ca²⁺浓度瞬时增加，用酵母与 Giliocladium deliquescens激发子（主要成分可能是分子量为5-30kd的多肽）处理则引起持续时间较长的ca²⁺增加。病原激发子通常是指在病原菌侵入后使寄主产生防御反应的任何分子，如寡聚糖素（Oligosaccharins）、水杨酸（SaliCylic acid）、茉莉酸（Jasmcnic acid）等，它们引起的信号转导过程已有许多报道。

　　Braam和Davis在拟南芬上的实验十分有趣,他们发现触摸植物十分钟后引起五个基因（TCH1－TCH5）高效表达。而在用多种环境刺激因子如模拟雨水（喷水）、根部供水、切伤、吹风、黑暗处理、移动、音乐、湿度变化时，除后三者外都可引起TCH1-4中全部或部分表达的变化，mRNA水平增加可达100倍之巨。这几个基因中，TCH1确认为CaM，而TCH2与3为CaM相关蛋白（44－70％氨基酸序列与CaM相同），作者认为环境刺激引起信号转导既可通过胞内ca²⁺信使本身，亦可通过其受体CaM变化而实现。触摸使植物形态发生改变是一个古老之谜，如今开始有了分子生物学的新解释。

　　环境刺激通过信号传导引起的植物生理反应，常通过基因活化与蛋白质合成来起作用，此谓之长期反应（Long term responses），如光形态建成及向触性形态建成(thigmomorphogenesis)等等；也有的生理反应与基因活化及蛋白质合成无关，称之为短期反应(Short term responses），如仅仅激活酶、引起细胞运动反应等等。

　　（二）胞间化学信号

　　当环境刺激作用位点与效应位点处在植物体的不同部位时，就必然有胞间信号传递信息。例如重力作用于根冠细胞的淀粉体，使根的伸长区产生反应并由IAA传递信息；土壤干旱引起地上部叶片气孔关闭时，由ABA等传递信息；叶片虫咬伤害引起周身性防御反应可能由寡聚糖和ABA等传递信息等等。

　　目前对逆境信息感受和传递的研究已引起了普遍的重视，这方面的研究结果为植物对环境刺激信号转导提供了很好的证据。其中一个例子就是土壤干旱协迫引起叶片反应之间的胞间信息过程，早期认为这种传递是通过水势信号，但在叶片水分还没有发生可检测的变化前，叶片反应如延伸速率已随土壤干旱明显下降。Davies等人认为： ABA在这信号传递中起着主要作用。玉米、向日葵等根尖在遭受干旱后、合成ABA，然后通过导管向地上部运输，最后到达叶片细胞的质外体，并作用于气孔和表皮细胞引起气孔关闭。

　　Ryan等早在20年前就发现，植物一个叶片遭受虫咬伤害后，会诱导本叶或其它叶片pin基因活化，产生蛋白酶抑制物（PIs），以阻碍病原或害虫进一步侵害，但对局部伤害却引起周身性反应的信息转导途径始终不清楚。近年来，Bowles等人指出，如伤害后立即除去受害叶，其它叶片就不会产生PIs，但如果将受害叶细胞壁水解片段（主要是寡聚糖加到叶片中，又可模拟伤害反应诱导PIS产生，从而认为寡聚糖是受伤叶片中释放到维管束后转移，诱导PIS基因活化的信号分子（PllF，即PI诱导因子）。WillmitZer等则认为ABA是PllF，因为伤害使受害叶及相邻叶片的ABA大大增加,直接喷洒ABA于番茄叶片亦可活化pin基因；而缺乏ABA番茄突变体对伤害引起的pin基因活化能力大大减弱。在其它植物如烟草转基因植株中，发现乙烯和细胞分裂素（正效应剂）和IAA(负效应剂)也影响 pin基因启动子的活性。

　　看来．在植物体内，植物激素，尤其是ABA充当了主要的细胞间化学信号分子，而且也已进一步查明多种植物激素，如ABA、IAA、GA等都可引起胞内信号，如细胞溶质ca²⁺浓度的增加。其它生长调节有关的化学物质如壳梭孢菌素（Fusicoccin），水杨酸(Salicylic acid），寡聚半乳糖等也都可能是胞间信号分子。

　　（三）胞间物理信号

　　植物体内是否普遍具有胞间的电信号联系一直是个令人困惑的问题。目前认为，在藻类和一些敏感性高等植物（如含羞草等）中具有动作电信是无疑的。娄成后院士通过毕生的研究，明确指出“电波的信息传递在高等植物中是普遍存在的”。他在近年发表的文章中已详细地阐述了这个观点．认为：(1)植物为了对环境变化作出反应，既需要专一的化学信息传递，也需要快速的电波传递。（2）植物的电波传递有多种形式：高敏感的植物对外界刺激无需达到伤害程度即可产生动作电波（AP）,中等敏感植物在伤害刺激条件下产生变异电波（VP）；最不敏感的植物只引起不可传递的局部电位变化，而且植物都有经逆境或剧烈刺激激活的潜在兴奋性。（3）与动物相似，植物的电波也是质膜极化及透性变化的结果，而且伴随有化学信号的产生（如乙酰胆碱）。（4）植物电波长途传递途径是维管束，短途传递则通过共质体以及质外体。（5）各种电波传递都可以产生生理效应。

　　二 、跨膜信号转换：受体与G蛋白

　　（一）受体

　　受体，尤其是质膜外侧受体是胞间信使起作用并转换为胞内信使的首要位点，同时也是植物信号转导研究中的薄弱环节。

　　曾用传统的生物化学分析方法，对生长素和脱落酸受体进行过长期的研究，甚至已将生长素结合蛋白从玉米很尖微粒体上增溶纯化，克隆和氨基酸序列测定，但仍未能确定受体位点及其作用。尽管某些植物受体可能具有多元位点（如膜定位的与可溶性的），但最近有愈来愈多的事实表明：ABA、赤霉素及生长素受体位于质膜外侧。如将ABA微注射到鸭趾草保卫细胞或对细胞进行外浸渍的试验证明：它在质膜外侧被接受，而在内侧抑制气孔开放或诱导气孔关闭；用非透性GA或微注射抗特异性抗体（anti-idiotytic antibodies）等方法，证明大麦糊粉层细胞质膜外表面受体对GA的作用极为重要；还有报道认为生长素是在质膜外侧被接受的。如果激素效应位点在质膜外恻，那么接下来必然涉及信息的跨膜转移及胞内信号传递等过程应。

　　将分子生物学方法运用于植物受体的研究大大促进了其发展。Chang等最近在拟南芥中克隆并测序了一个对乙烯敏感etri基因，其产物ETRI可能就是乙烯受体，因为它处于信号传递的上游，且具跨膜结构，其缺失突变植株中，乙烯结合大大减少；而处于etri下游的一个基因产物CTRI，亦已被查明是一种苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶。

　　光敏素是植物的光受体之一，人们对它的认识远远超过对植物激素受体的认识。它早已被分离纯化，基因克隆。近年来其分子结构的研究已能揭示其1100多个氨基酸序列包括生色团结合位点，及决定完整光敏素吸收光谱的结构区域在N端区；而与二聚体形成及Pfr降解有关结构在C端区；与光敏素生物学活性有关的结构在N及C端区的两头。光敏素的空间结构也已测得，它由二聚体组成，两个单体在C端区域相连。非常有趣的是，从藓类Ceratodom Rurpureus中克隆了一个新的光敏素基因，c端区一头多了一个300个氨基酸的结构区域，它与已知真核生物蛋白激酶的催化区域高度同源。初步研究表明Ceratodom的光敏素具有蛋白激酶活性，它的磷酸化活性为红光/远红光可逆调节，且能使光敏素自身磷酸化，这是植物中第一个被发现的光依赖蛋白激酶，而且光敏素N端（生色团所在区域）作为光受体分子，另一端（即C端）在光刺激后产生蛋白激酶活性，其作用方式与动物细胞膜上的受体蛋白激酶非常相似。

　　当前植物受体研究的一个新领域是对于激发子（elicitor）及植物毒素(phytotoxin）受体的研究。植物对病原微生物产生防御反应，常常是由病原或寄主植物细胞壁衍生的激发子引起的。激发子的作用首先也是作用于寄主细胞表面受体，通过两者的识别与受体激活引起胞内的防御反应，如产生植物抗毒素(phytoalexin)等。大豆为一种真菌(P.megasperma f.sp)浸染时，产生的激发子为1,3-1,6-β-葡聚糖。早已发现细胞膜上具此葡聚糖的可饱和的、可逆的高亲合性结合位点。后来从大豆细胞微粒体中增溶了与激发子结合的活性物质，并证明它是一糖蛋白，可被蛋白酶酶解及加热而失活。植物毒素一壳孢菌素，可引起质膜上H⁺-ATPase活化，它的结合蛋白已在几种高等植物细胞质膜中检出，而且证明是由29－31和 30－33Kd两个亚基组成。

　　（二）G蛋白（G proteins）

　　G蛋白的发现，是生物学上一个重大成就。Gilman与Rodbell因此获得1994年诺贝尔医学生理奖。植物上G蛋白的研究，始于80年代后朝，当时主要是用放射性³²P－GTP或³⁵S－GTPrS结合试验。证明了在豌豆、胡芦鲜、菠菜细胞膜上可能存在G蛋白。目前，G蛋白或其类似物在植物体内的存在已被肯定。

　　在G蛋白参与细胞功能调节的研究方面，Romero等作了十分有说服力的工作。他们首先用从预照光燕麦苗中分离出来的蛋白组份与³²P-GTPrS结合，试验表明，红光照射与远红光照射或暗处理相比，有明显促进作用;加外源远红光照射形式的光敏素（Pr）使结合能力减弱，而加外源红光照射形式的光敏素（Pfr）则使结合能力完全保持。已知叶绿素A、B结合蛋白基因Cab和光敏素基因phy是分别为光敏素正负调节的， Romero等发现黄化燕麦幼苗在黑暗中如加入霍乱毒素（cholera toxin），能使Cab基因高表达而phy基因低表达。霍乱毒素是Gs蛋白活化剂，它可将Gsα亚基ADP-核糖基化而持续性活化。

　　总之．无论用GTP结合试验，免疫反应，分离纯化，以及分子生物学和生理试验，都说明植物中存在G蛋白类似物且具有调节功能，但其结构及作用机制等仍有待于继续研究。

　　三、细胞内信号

　　（一）Ca²⁺信号系统

　　1 Ca²⁺信使

　　Ca²⁺．CaM信号系统是植物中研究得最多，了解较清楚的一个胞内信号系统。近来，这方面又取得许多突破性的进展。

　　要证实一种外界刺激或激素引起细胞反应是通过Ca²⁺作为中间信使而实现的，最好的证据就是要测出细胞溶质内游离Ca²⁺浓度的变化。这种测定恰恰是细胞Ca²⁺信使研究中一大难点。由于方法学上的突破，特别是水母发光蛋白测定法的应用，自90年代以来，植物细胞受外界刺激及植物生长物质作用下溶质中Ca²⁺浓度变化已取得许多资料。已测到可引起胞内溶质Ca²⁺变化的外界刺激因子有触摸、低温、红光及紫外光、重力、多种胁迫、风及真菌激发子（elicitor），植物生物质有 ABA、生长素、赤霉素、细胞分裂素。

　　不同的胞外刺激所引起的胞内Ca²⁺ 信号不单是 Ca²⁺浓度的变化，还有多种Ca²⁺信号形式，其中多数是产生一种突发的短暂(以秒或分计）而单一的Ca²⁺峰；而激素中的GA及细胞分裂素常常表现为一种适度而持久的（以分到小时计）的Ca²⁺增加，而后缓慢回落；ABA生长素则常表现为Ca²⁺振荡（Ca²⁺Oscillation,即出现重复的Ca²⁺峰）。

　　Ca²⁺信号产生及灭活的基础是胞内的Ca²⁺分布及细胞存在复杂的 Ca²⁺转移系统。已明确植物细胞溶质Ca²⁺通常为0.1μmol/L ,这是胞内Ca²⁺信号产生的基础.在植物细胞Ca²⁺转移系统方面，近年来也取得许多重要的进展。质膜型Ca²⁺泵蛋白已从玉米叶和鸭趾草细胞上纯化并重组入脂质体，并表现出ATP依赖的Ca²⁺吸收。一些单子叶及双子叶植物细胞的内质网上可能存在一种质膜类型的CaM依赖的Ca²⁺泵，它已被分离并及功能重组成功。植物液泡在Ca²⁺信号中的作用，十分引人注目。已从燕麦富含液泡膜的囊泡中分离并鉴定出了溶H^＋／Ca²⁺交换系统蛋白。Gavin等还报道玉米根液泡膜上存在着CaM依赖的Ca²⁺泵。也有报道说液泡上存在两种Ca²⁺通道：一种是Ip₃诱导的Ca²⁺释放通道，另一种则是在甜菜根上发现的不依赖IP₃而依赖电压Ca²⁺通道。因此，作为一个胞内信号源，液泡膜上钙进出系统是比较完善的。

　　2 钙调节蛋白

　　胞内Ca²⁺信号通过其受体一一钙调节蛋白传递信息。植物中深入研究过的钙调节蛋白主要有两种：钙调素（CaM）与钙依赖（但不依赖CaM）的蛋白激酶。后者将在后面介绍。

　　钙调素仍是最重要的多功能Ca²⁺信号受体。近年来在CaM基因结构、基因表达及钙调素结合蛋白的研究上取得一些进展。首先在多种植物上发现了CaM DNA克隆异型（isoform）。如拟南芥中存在多拷贝的CaM基因，即ACaM－l、ACaM－2、AcaM－3，它们之间同源性为86％。其中AcaM－l可在体内（如根内）正常表达，而ACaM－2与AcaM－3在根中不表达，后二者编码的蛋白质序列与AcaM-1区别在Ca²⁺结合域之外的4个保守位置上。试验表明：不同的CaM基因对触摸、光暗、盐胁迫等刺激有不同的反应。

　　（二）肌醇磷脂信号系统

　　胞外信号到达靶细胞后，引发质膜上磷脂酶C活化，使质膜上的磷脂酰肌醇水解产生IP₃与DG两个胞内信使，这一信息传递系统便称为肌醇磷脂信号系统，由于产生的胞内信号有两种，因此又称为双信使系统。

　　80年代后期的研究已肯定植物细胞质膜中存在三种主要的磷酯酰肌醇，即PI、PI（4）P及 PI（4，5）P₂；PI（4，5）P₂水解产生的肌醇三磷酸（IP₃）及甘油二酯（DG）两个胞内信使；以及两种信使进一步代谢的产物（如贮藏器官中的植酸即六磷酸肌醇）。同时整个磷酯酰肌醇代谢所涉及的多种酶，如磷酯酶C、质膜上的PI及PI（4）P激酶、DG激酶和多种磷酸酶也已被鉴定出来。近来，还发现植物质膜上的磷酯酰肌醇主要存在于胞质面，而且在激素（2，4-D、IAA、GA、CK）、低渗与光刺激等条件下，其周转率明显加快。这些都为植物中可能存在胞内双信使奠定了基础。

　　双信使系统中，IP₃通过调节 Ca²⁺浓度变化、DG通过激活蛋白激酶 C（pKC）传递信息。植物细胞中存在IP₃/Ca²⁺传递途径已获得许多试验结果的支持。如已知IP₃引起植物细胞溶质 Ca²⁺增加，其来源为液泡．而且液泡膜上存在 IP₃结合蛋白。近年来，已有证据表明，IP₃/Ca²⁺系统在干旱和ABA引起的气孔开闭（如蚕豆．豌豆中）、酸胁迫下衣藻鞭毛脱落、雨树小叶与花膨压运动、植物对病原微生物浸染及激发子诱导等环境刺激所引起的快速反应中起信号传导作用。但DG/PKC途径在植物细胞中的存在仍有疑问。主要是未能确认存在PKC（蛋白激C）。植物细胞中报道的PKC类似物都与动物中PKC有所不同，如其活性不完全依赖于磷脂酰丝氨酸（PS），或氨基酸序列无明显同源性等，所以植物中可能存在不同于 PKC的蛋白激酶但功能与 PKC相似。

　　（三）环核苷酸信号系统

　　在植物中Cyclic AMP是否为第二信使已争论了近20年。过去由于缺乏明确的事实说明植物中存在 cAMP信号转导分子途径的各个组分，一般人都对此持怀疑态度。最近因为资料的积累，有人提出个问题值得重新考虑。植物中cAMP浓度低是无疑的，一般在可检测程度(0.5pmol/g鲜重）之下，而外源应用cAMP可产生生理效应的浓度常常高几个数量级。但近年来发现，植物中cAMP浓度往往随环境、植物不同部位和刺激后不同时间而变化。还有人证明了，外源应用cAMP常被植物组织代谢分解掉，因而加入磷酸二酯酶(PDE)桔抗剂才有生理效应，这可能是外源高浓度 cAMP才有效的原因之一。

　　在cAMP的生理功能方面，它可以调节植物中的 K⁺和Ca²⁺通道而可能无需经磷酸化。此外，cAMP反应因子结合蛋白（CREB）是动物中一种转录因子，且为PKA C亚基受体，它结合到DNA相应位置后可调节基因转录。在植物中也克隆到一种转录因子，它与CREB高度同源，说明有可能植cAMP与动物中一样参与基因转录调节。因而，剩下的问题就是要证实以上调节功能否在体内（in vivo）也存在。

　　对植物体内环鸟苷酸过去研究极少。蔡南海实验室令人信服地证实，在叶绿体光诱导花色素的合成过程中，cGMP参与受体G蛋白之后的下游信号转导过程。

　　（四）蛋白质的可逆磷酸化

　　l 蛋白激酶

　　胞内信使一般需要依赖蛋白质磷酸化作用进行中介、放大，才能最后完成信号传递过程。采取分子生物学方法，已使植物蛋白激酶研究取得明显进展，目前已在植物中分离出了70多个蛋白激酶基因。

　　在动物细胞中几个主要胞内信使依赖的蛋白质激酶如 cAMP依赖的激酶 A（PKA）、cGTP依赖的激酶G（PKG）、磷脂与Ca²⁺依赖的激酶C（PKC）、及多功能Ca²⁺ CaM依赖的激酶（CaMPK Ⅱ）都已完成纯化，基本结构、基因克隆以及许多生理调节功能的研究。相比之下，植物上对这些酶了解很少，相反在动物细胞中极少报道的依赖钙（而不依赖CaM及磷脂）的蛋白激酶（CDPK）可能在植物中处于主导地位。

　　此外 Watillon等人最近报道从苹果中分离、鉴定了一个 DNA片断，它与钙调素结合蛋白相应，在其编码的蛋白质中含有苏／丝氨酸蛋白激酶催化区域及 与Ca^2＋CaM结合的调节区域，因而与动物中多功能CaMPK Ⅱ十分相似。

　　2 蛋白磷酸酯酶

　　蛋白质磷酸酯酶逆转蛋白质的磷酸化作用，起到终止信号的逆向调节作用，因而与蛋白激酶同等重要的意义，但有关这方面的报道极少。

　　植物信号转导作为一个新的研究领域，近年来虽然已取得重要进展，但也只能勾画个轮廓，其很多细节尚待研究。