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第四讲：微生物资源的开发和利用 第二节 微生物杀虫剂 3、利用生物工程技术创造出多种高效广谱的杀虫品系，提高杀虫效果
从最初梅契尼可夫利用绿僵菌防治小麦金龟子幼虫的尝试以来，微生物防治害虫的历史迄今已有一百多年了。微生物杀虫，是微生物防治的一个重要组成部分，随着目前环境污染的日益严重，人们对各种“绿色”商品的需要不断高涨的情况下，微生物杀虫剂可以说是顺应了这一潮流，因此，目前世界各国政府对微生物防治害虫均予高度重视，微生物杀虫剂在各国也有了较为广泛的应用。 目前已知的杀虫微生物有近3000种。杀虫微生物是指那些由于微生物本身寄生导致宿主昆虫致病和死亡，或者其代谢产物能直接杀死昆虫的微生物。因此，用于控制害虫虫口的微生物或其产物叫微生物杀虫剂。 人类从刀耕火种以来，一直备受害虫的威胁，给人类的生活造成了多种危害，例如大规模侵害农作物，传播人畜疾病，危害人类健康等。长期以来人们寄希望于化学农药，来控制害虫的繁衍和蔓延。但是长期大剂量地使用化学合成的农药，致使多种害虫对化学杀虫剂产生了一定的抗性，因此不但不能有效地控制害虫，结果还面临着三大难题无法解决，①环境污染，残毒上升，人畜均遭毒害 ；②用药浓度不断提高，防治费用不断增加，不得不无休止地研制新农药； ③杀伤天敌，破坏了生态平衡，引起害虫再猖獗和次虫害虫大爆发，导致自然界中恶性循环。这在国外称为“三R”（即:Residue,Resistance and Resurgence）,意思是残毒、抗性、再猖獗三大问题。由于化学杀虫剂的诸多缺点，人们始终在寻找控制害虫的更为安全有效的方法。微生物杀虫剂便是人们的选择之一，近年来许多新型的微生物杀虫剂相继问世，并在害虫的防治中发挥了巨大的作用。与化学农药相比，微生物杀虫剂用于防治害虫有如下优点： （1）害虫不易产生抗药性 化学杀虫剂自开始使用以来，一直在不断地更新换代，而害虫的抗药性却直线上升。到目前为止还没有确切的证据来证明昆虫对微生物杀虫剂能够产生抗性。人们综合了大量有关害虫对各种病原微生物的抗性的研究材料后，认为杀虫微生物与害虫在长期共同的生活过程中，适应了害虫的防卫体系，虽然害虫对微生物长期反复的侵染会产生一定的抗性，但是这种抗性的增长是极其缓慢的，也就是说害虫对一些病原微生物的免疫力多年来始终保持在一个很低的水平。二十多年前就已开始使用的微生物杀虫剂一苏云金杆菌制剂至今为止尚未发现因害虫抗性增加而影响防治效果就是很好的例证。 （2）特异性强，对脊椎动物和人类无害 害虫病原体对宿主有很强的选择性。因此，微生物杀虫剂具有对人畜等防治目标以外生物（非目标生物non-target organism）安全无害的特点，如已有大量事实证明，苏云金杆菌制剂对于鱼类、禽类、哺乳动物和人类是完全安全的。 （3）有自然传播感染的能力 昆虫是各类昆虫病原体最适合的培养基，尤其对一些传染性病原体来说，甚至是不可代替的培养基，昆虫病原体使用后可在虫体内增值，产生芽孢、分子孢子、病毒多角体等具有感染力的繁殖体，这些繁殖体可在昆虫群落中自然传播去感染其它健康昆虫而造成流行病，尤其在虫口密度较高时蔓延传播更快，从而可以起到长期防治的作用，有些病原微生物虽然短期防治效果不佳，但一旦在某一生态环境中定居后，在适宜的环境条件下就可引起昆虫的疾病和死亡，成为经常性抑制虫口的自然因素。这是任何化学杀虫剂所不具备的特点。 （4）不污染环境 常用的微生物杀虫剂中所含的有效成分对植物、脊椎动物和人类没有毒性或致病性，所以微生物杀虫剂不会污染环境，可以说是一种环保生物农药。 （5）能保护害虫天敌 微生物杀虫剂的选择性强，能有区别地作用于害虫和害虫的天敌，它们可杀死害虫而对天敌无害。保持了天敌对害虫的制约作用，使得生态平衡向着有利于天敌的方面发展。 （6）容易进行生产 许多昆虫病原微生物已能进行工业化的生产，不少种类还可以采用简易的固体发酵法进行生产，无需特别的设备条件。 当然，微生物杀虫剂也有缺点，如杀虫效果较慢、受环境条件影响较大和成本较高等，从而限制了它的应用。现在人们可以通过生物技术途径筛选或构建具有优良性能的菌株，克服缺点，改善产品的性能，提高杀虫效果。 目前的微生物杀虫剂包括病毒杀虫剂，细菌杀虫剂真菌杀虫剂及放线菌产生的杀虫素等。不同的杀虫微生物具有各自的特点，表4-2简要概括了不同杀虫微生物的杀虫特点。 表4-2 不同杀虫微生物的主要特点
细菌杀虫剂（Bacterial insecticide）是利用对某些昆虫有致病或致死作用的杀虫细菌所含有的活性成分或菌本身制成的，用于防治和杀死目标昆虫的生物杀虫制剂。细菌杀虫剂自问世间以来发展较快，尤其是近几十年来，细菌杀虫剂的研究和应用取得了显著的成果，已成为生物农药家族的主导产品。美国、日本、西德、法国等国家对细菌杀虫剂的研究作了大量工作，目前细菌杀虫剂已发展成有一定规模的产业，全世界约有30多个国家的100多家公司生产细菌杀虫剂，品种可达150多个，并已逐渐应用于蔬菜、林业、园艺、卫生害虫等领域的害虫防治中。目前已知的杀虫细菌约有100多种，但作为商品生产并投入使用的主要是苏云金芽孢杆菌，（Bacillus thuringiensis）, 球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）日本金龟子芽孢杆菌（Bacillus popilliae）和缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)。 （1）苏云金芽孢杆菌杀虫剂 苏云金芽孢杆菌最早发现于1902年，1938年世界上第一个苏云金芽孢杆菌制剂Sporeine在法国问世，从而掀开了苏云金芽孢杆菌杀虫剂生产的序幕。特别是近10年来，苏云金杆菌已经成为加拿大控制枞色卷蛾（spruce budworm）的主要手段。在其它国家，苏云金杆菌运用于控制毛虫（caterprillar）。吉卜赛毒蛾（gypsy moths）等。目前全世界约有苏云金芽孢杆菌杀虫剂100个多个品种，年销售额近1亿美元。 对于苏云金芽孢杆菌的致病机制科学家们已作了大量的研究，现已证明其杀死宿主昆虫主要靠其芽孢及毒素。在敏感昆虫吞食苏云金芽孢杆菌的芽孢后，芽孢在昆虫肠道中迅速萌发并增殖，引起肠道麻痹，最后穿透肠壁进入血液，引起昆虫败血症而中毒死亡。苏云金杆菌所产生的毒素主要是β外毒素和δ内毒素。δ内毒素存在于伴孢晶体中，它是所有苏云金杆菌菌株共有的毒素。在苏云金芽孢杆菌的杀虫活性成分中，δ-内毒素（亦称为“杀虫晶体蛋白”Insecticidal crystal protein,ICPs）是最主要的，也是被研究得最充分的一类毒素。伴孢晶体是某些芽些杆菌伴随着芽孢的产生而出现的一种毒性蛋白，它不溶于水和有机溶剂，可溶于碱性溶液，具有一定的耐热性，100℃下仍能保持毒性30分钟，β外毒素是一种腺嘌呤核苷酸衍生物，相对分子量约为700,它是苏云金芽孢杆菌在一定培养条件下所产生的细胞外毒素，可溶于水，热稳定性好，经高温高压处理后仍能保持毒性。β毒素的作用机制是，它是RNA聚合酶的竟争抑制剂，可干扰有关激素的合成，从而导致幼虫发育奇型或不能正常化蛹。苏云金芽孢杆菌虽然有较强的杀虫能力，但它必须经吞食过程进入体内才能杀死昆虫。因此在实际应用中，将其与吸引昆虫的物质一起喷洒，可以增加昆虫吞食的可能性。 从80年代中后期开始，随着生物技术的广泛应用，人们利用DNA重组技术对毒素基因进入改造，构建综合性能优良的重组菌株并发展遗传重组杀虫剂已成为国外各大生物农药公司的目标，至90年代初，已有10余种遗传重组杀虫剂被批准进行后期田间试验。通过构建重组菌株可以实现以下目标：（1）扩大杀虫谱；（2）延长杀虫毒素的持效期及改进释放性能；（3）提高毒力和杀虫晶体蛋白的产量。 （2）球形芽孢杆菌杀虫剂： 1965年以前，人们还不知道球形芽孢杆菌是病原菌，直到kellen等人从脉毛蚊（Cullseta incidens）中分离出一株球形芽孢杆菌后，才了解到它对蚊虫有致病性。迄今已分离到各种对球形芽孢杆菌的菌株近700株，仅有50多个菌株是有毒菌株。球状芽孢杆菌有两类毒素，一种来自营养细胞，是一种在营养生长期产生的蛋白质，这种蛋白的基因已被克隆和作序列分析，另一种毒素来源于伴孢晶体，是分子量分别为42Ku和51Ku的蛋白质，并且只有当两种蛋白质在一起时才产生毒性，球形芽孢杆菌的伴孢晶体与苏云金芽孢杆菌不同，它的伴孢晶体被部分地包在芽孢外壁之中，使得芽孢和伴孢晶体在离体的条件下仍是一个整体。 球形芽孢杆菌的杀虫范围仅限于蚊虫的幼虫，它通过取食过程进行感染，蚊子的幼虫在取食8-12h后，即可发生死亡，幼虫吞入球状芽孢杆菌后，菌体在肠道中被消化，细胞壁破裂，菌体内的毒素释放出来，从而杀死蚊虫的幼虫。 球状芽孢杆菌在昆虫死后，可以在虫尸中重新增殖，芽孢的数目增加。由此可见球状芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体在环境中持效期较长，并有可能在环境中再循环。因此，从80年代中后期开始，球状芽孢杆菌高毒菌株的筛选工作开始受到重视。迄今为止，美国、法国及我国等10个国家研制了不同剂型的产品十余种，但多是一些实验剂型，主要用于杀蚊幼虫的效果评价。我国生产了Bs-10,C3-41等乳剂，曾在野外大面积用于蚊虫的防治。 （3）日本金龟子芽孢杆菌制剂 日本金龟芽孢杆菌能使日本金龟子幼虫（蛴螬）生产A型乳状病。用金龟子芽孢杆菌防治日本金龟子是生物防治最典型的例子之一。第一个日本金龟子芽孢杆菌制剂于1950年在美国登记，成为美国政府批准的第一个生物防治制剂。金龟子芽孢杆菌主要通过芽孢感染和传播，芽孢经口摄入。当幼虫吞食芽孢后，芽孢可以在肠道中萌发成杆状的营养细胞，营养细胞能够侵染中肠细胞，随后穿过肠壁进入体腔。金龟子芽孢杆菌在体腔中的增殖经历4个时期。（1）芽孢萌发期，即所有细菌都是营养细胞；（2）营养繁殖期，即90%是营养细胞，（3）芽孢形成期，65-70%是营养细胞，17%-28%是含芽孢的细胞，（4）芽孢成熟期，即95%的细菌含芽胞。感染约10-14天后，被感染的昆虫幼虫死亡。幼虫的死亡原因还不是很清楚，一般认为是营养物质耗尽，或是存在稳定毒素，或是氧化酶代谢紊乱。 金龟子芽孢杆菌的芽孢能在寄主体外存活，营养体也能在人工培养基上生长繁殖，但却不能在人工培养基上正常地形成芽孢。目前，苏云金芽孢杆菌制剂都是采用幼虫活体培养的方式来进行，在人工培养基中进行发酵生产尚处于试验阶段。近年来，国外试图克隆编码金龟子芽孢杆菌的杀虫活性蛋白的基因，并将其导入其它受体菌中进行表达，这为进一步开发利用此菌提供了新的途径。 在昆虫的病原微生物中，种类最多的是真菌。目前，世界上有记载的杀虫真菌约有100属，800多种。真菌是最早被发现引起昆虫疾病的微生物，也是首先被研制成杀虫剂的微生物。国外应用真菌治虫开始于十九世纪。1835年美国第一次发现白僵菌能引起家蚕僵菌，1934年利用白僵菌防治玉米螟 。1937年加拿大也利用白僵菌大面积防治玉米螟 ，幼虫死亡率达60～70%。目前国际上以白僵菌的研究和利用最为广泛。白僵菌除防治玉米螟外，对马铃薯、甲虫、松毛虫、松扁蝽、甜菜象鼻虫等都有一定的效果。人们对真菌对害虫的致病机制也进行了研究。通常真菌感染虫体后，先分泌毒素杀死寄主，然后在寄主的尸体上生长发育，最终使虫尸充满菌丝而僵硬。 我国在使用真菌杀虫剂方面已有多年的成功经验，例如把白僵菌用于防治松毛虫、松针毒蛾、油桐蚜虫、茶叶毒蛾、大豆食心虫、杨树天牛等害虫，均取得了较好的效果。 利用真菌防治虫害时，可以通过人工培养大量收获真菌菌体或分子孢子，将其制成菌剂，进行大面积喷洒。目前许多真菌杀虫剂都已进入了大规模的商业化生产阶段。可以采用固体发酵法或液体深层发酵法生产真菌杀虫剂。由于真菌菌体和分生孢子很容易获得，因而人们还没有尝试去通过DNA重组手段提高真菌的杀虫能力。 在自然界，昆虫病毒可以感染许多林业害虫。目前已发现的昆虫病毒大约有1200种，我国分离出的昆虫病毒有近200种，其中很多都具有生物防治潜力。70年代初我国开始重视应用昆虫病毒防治大田害虫的试验研究工作，并取得了良好的防治效果。目前已有40多种病毒用于防治农林害虫，已列入商品生产的有棉铃虫病毒、甘蓝夜蛾病毒、粘虫病毒、松叶蜂病毒和松毛虫病毒等。 昆虫病毒粒子可以形成包函体，即单个或多个病毒粒子被包围在一个由蛋白质构成的结构中，包函体可以有效地保护病毒颗粒不受损伤，并且在离开虫体数年后仍可保持侵染活性。病毒包函体通常以取食过程进入昆虫的消化管，经碱性昆虫消化液裂解后释放出病毒粒子，这些病毒粒子进一步侵染昆虫体内的各种细胞，直至造成昆虫死亡。 昆虫病毒可分为四类：即核型多角体病毒，颗粒体病毒质型多角体病毒和昆虫痘病毒。 核型多角病毒是世界卫生组织和粮农组织推荐使用的一种生物杀虫剂。它对宿主范围有很强的特异性，因此对人、植物和害虫的天敌均无危害，是目前应用最为成功的昆虫病毒。我国已有棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂的商品问世，应用于棉铃虫的防治。颗粒体病毒和质型多角体病毒也是目前研究和应用效为深入和广泛的昆虫病毒，尤其是质型多角体病毒，人们发现它不仅能侵染幼虫，而且能经由卵传染给昆虫的子代，这点在病毒的应用上具有十分重要的作用。目前对昆虫病毒的基因工程改造主要集中在杆状病毒，并且已成为病毒杀虫剂研究的热点。 近百年来，微生物杀虫剂的研究和发展，经历了许多曲折的过程。随着对滥用化学农药危害性的认识，以及对无公害绿色食品的需求和对环境保护意识的增强，人们清楚地认识到应用微生物杀虫剂不仅是单纯的治虫，而且有利于保护环境，有利用于生态平衡，有利于民族健康。当前微生物防治这一学科正在不断深入发展，新的高效微生物杀虫剂不断出现，防治的对象也在逐步扩大。目前微生物杀虫剂的研究有三个最引人注目的发展方向。一是从生态学的角度引进和应用天敌微生物以长期抑制害虫；二是从化学的角度，从杀虫微生物的代谢产物中提取高效低毒的杀虫物质；三是利用生物工程技术创造出多种高效广谱的杀虫品系，提高杀虫效果。 这种防治观念和传统的防治观念不同，它所强调的是杀虫微生物不仅要控制当时发生的虫害，而且可以在相当长的时间内在生态系统中生存下来，并能在数年内持继地控制某些害虫的数量。最成功的例子如：日本金龟子芽孢杆菌，有人将这种细菌制剂在马里兰应用之后，30余年一直控制着虫口。在北美，20世纪初，欧洲云杉锯蜂和欧洲松叶锯蜂无意中从欧美传到北美。锯蜂核型多角体病毒便随这些寄主一起被引进，病毒迅速传播，成为惊人的流行性病害，从而减少了锯蜂的虫口，挽救了许多有价值的云杉森林。而且这种病毒在生态系统中保存了下来，持续多年控制了欧洲云杉锯蜂的危害。因此，在复杂的生态系统中以长期控制害虫为目的，微生物杀虫剂的研究是一个日益引起重视的研究方向，随着研究工作的不断深入，必将开发出更有效的产品。 从微生物的代谢产物中寻找高效低毒、易被分解的杀虫物质，这是微生物杀虫剂研究的又一热点。微生物具有易培养、易进行大规模工业化生产等特点，所以从事微生物防治和从事化学合成的人均很重视这项研究。近几年的研究已经取得了一些可喜的进展。例如：苏云金芽孢杆菌的蛋白质毒素经过一定的方法处理可得到分子量较小的活性多肽，人们试图测定这些多活性多肽的氨基酸排列顺序，在实验室中合成杀虫多肽。在真菌中有很多种类可产生杀虫毒素，如白僵菌、绿僵菌、黄曲霉、棕曲霉等。人们对这些真菌所产生的毒素进行了大量的研究，测定其化学性质和分子结构，并进行了人口合成。日本生产的杀螨素和杀蝶素是两种微生物的代谢产物，均可作为杀螨剂使用。 3、利用生物工程技术创造出多种高效广谱的杀虫品系，提高杀虫效果 随着分子遗传学的迅速发展，为开展杀虫微生物的基因工程创造了良好的条件，使人们能够通过DNA重组技术创造出高效广谱的杀虫菌新品种。在这方面研究最多的是苏云金芽孢杆菌。目前人们已对苏云金晶体毒素蛋白的多个基因进行了分子克隆，并且对创造出针对多种害虫的微生物杀虫剂做了尝试，已应用基因工程构建了“杀虫工程菌”、“杀虫工程植物”，1984年首先将晶体毒素蛋白基因通过土壤农杆菌的Ti质粒成功地转移至烟草中，使晶体毒素基因在高等植物中得到了高效表达。在昆虫病毒的研究方面也取得了可喜的进展，人们已经利用杆状病毒表达载体系统在真核细胞中表达了许多外源目的基因，并利重组DNA技术构建了具有高毒力的、潜伏期短的“工程病毒”。我们相信，随着科学技术的不断进步，基因工程杀虫剂必将为杀虫菌的应用开拓广阔的前景。
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