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第四讲：微生物资源的开发和利用 第一节 微生物与可降解塑料
微生物是生物界中最小的生物，其形体微小，外貌不显，但它的作用却是不可估量的。随着现代生物技术的发展，有益微生物在社会生产力的发展中发挥着重要作用，微生物生产已与动植物生产并列成为生物产业三大支柱之一。当前人类正面临着人口爆炸、粮食紧缺、能源匮乏、资源枯竭、生态恶化等多种危机，进入21世纪后，会遇到从利用有限的矿物资源时代过渡到利用无限的生物资源时代而生产的一系列问题。由于微生物本身所具用的特点，使得它能够在解决人类的各种危机中发挥不可替代的独特作用。因此，开发和利用丰富的微生物资源，是21世纪生命科学的生命力所在。 随着石油化学工业的迅速发展，塑料以其质轻、价廉和性能优良为特点被广泛应用，其用途已渗透到国民经济各部门，人们的衣食住行无不直接或间接地与其密切相关。它和钢铁、木材、水泥并列为材料领域的四大支柱。然而，塑料给人们带来物质文明的同时，其大量使用后产生的塑料废弃物与日俱增，造成“白色污染”，使环境恶化，生态平衡破坏。据报道，每年废弃到海洋中的塑料有数十万吨。这些废弃的塑料一方面可被海洋生物吞食，另一方面可将海洋生物缠绕，结果致使一些海洋生物因此而丧生。陆地上的塑料垃圾更为严重，危害更烈。例如，在农村废弃的农膜在耕地中大量积累，尤其是还在推广的超薄地膜更是无法回收，对作物生长造成严重危害而显著减产。在城市，由于尚缺少现代化垃圾填埋或焚烧设施，固体垃圾大多在市郊空地露天弃置，塑料垃圾袋、购物袋、餐具、食品包装袋、杂品和工业品材料等一次性塑料废弃物随地流散，严重地破坏了环境卫生。因此，随着全球性“白色污染”的日趋严重和人类对改善自身生存环境意识的日益增强，人们正在寻求可与环境同化的高分子材料——可生物降解塑料，取代不能生物降解的塑料，消除“白色污染”。 美国试验与材料协会（ASTM）把生物降解塑料定义为：能够被自然界存在的微生物如细菌、真菌和藻类的作用而引起降解的一类塑料。因此，从降解的程度上看，生物降解塑料可分为生物崩坏性塑料（Biodestructible plastics）和完全生物降解塑料（Biodegradable platics）。 生物崩坏性塑料是一种不能完全生物降解塑料。其研究重点是在通用塑料中混入具有生物降解特性的组分，当其制品消费后，经一定时间可生物降解组分降解，至使其制品丧失力学性能与形状，以很小的粒子或碎片分散在自然界，避免造成宏观污染，但微观上的影响依然存在。由于生物崩坏性塑料可以沿用通用塑料的加工工艺和设备，其生产成本较低，仍然有一定的消费市场。但是它不能从根本上解决“白色污染”。 （１） 化学合成的完全生物降解塑料 选择适宜的单体和催化体系，经化学合成的方法制得可生物降解塑料，在这些塑料中，脂肪族聚酯、聚乙烯醇（PVA）和聚乙二醇等是代表产物。人们利用这些塑料易生物降解的特性对其进行深入、广泛的研究与开发。其中对脂肪族聚酯的研究尤为引人注目。 脂肪族聚酯可以被脂肪酶水解成小分子，然后再进一步被微生物同化。在众多的脂肪族聚酯中，聚已内酯（PCL）应用较广。 （２） 天然的完全可生物降解的高分子 利用植物中多糖类的纤维素、木质素和淀粉等，动物中的壳聚糖、聚氨基葡萄糖、动物胶以及海洋生物的藻类等，可制造出有价值的生物降解塑料。这类材料的最大特点是资源丰富，如淀粉，植物可以通过光合作用年复一年地产生淀粉，形成完全可持续发展的资源。此类材料中的典型例子是牌号为Novon的生物降解塑料。 （３） 用生物发酵技术合成的完全生物降解塑料 微生物在新陈代谢过程中，在合成蛋白质、核酸和多糖等大分子物质的同时, 在细胞内还贮存聚酯—聚b -羟基丁酸酯（PHB）。这是一种塑料样的可生物降解的高分子材料。早在70年代初，英国ICI化学公司使用Alealegenes Entropls菌通过微生物发酵途径，在普通发酵罐中合成了PHB，纯度约95%。美国W.R.Gyace公司已有中试规模生产。80年代，英国ICI化学公司将丙酸加入葡萄糖内，成功地合成了全新的3-羟基丁酸酯（3HB）和3-羟基戊酸酯（3HV）的无规共聚物，其商品名为Biopol。这种新型的共聚物可用注塑或吹塑的工艺方法，制造洗头膏瓶等化妆品容器以及外科手术用缝针，缝线等医用材料。利用它的生物降解特性，还可用于包裹医药、杀虫剂和除草剂等缓释体系药剂，还可开发一次性使用的盘子、尿布和薄膜等产品。英国已用大型发酵罐工厂化生产这种聚合物，年产600吨。我国武汉大学、清华大学、中国科学院微生物所等单位也都相继开展了有关PHB的生物合成，并且也都取得了很大进展。 这种新型的用生物发酵技术合成的完全可生物降解塑料可称为生物塑料。它具有降解性、实用性、安全性和不污染环境等特点，它一旦进入人类现实生活中则可称得上是“无公害塑料”。人们对它的使用与废弃都不会产生忧虑或担心。尽管人们很早就知道很多微生物细胞中都有PHB存在，也知道用生物发酵技术可以合成PHB，但是PHB的实用价值直至今日才被人们所认识。应该说，这种新型的生物塑料有着巨大的市场潜力，发展它不仅可以为工业、农业、医药以及人们的日常生活等方面提供新的材料来源，而且将会对消除“白色污染”改善人类自身的生存环境及环保事业的健康发展做出重要贡献。 自从1925年法国巴斯德研究所的Lemoigne首先从巨大芽孢杆菌细胞中发现有PHB以来，人们又先后发现了许多种类的原核微生物都能产生PHB，包括光能和化能自养及异养菌计65个属中的许多种。如假单胞菌属（Pseudomonas）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、固氮菌属（Azotobacter）、红螺菌属（Rhodospirillum）和甲基营养菌（Mecthy lotrophs）等。目前世界各国所用的PHB生产菌种主要是真养产碱杆菌、固氮菌和假单胞菌。 不同的微生物合成PHB的途径不同，基质不同其合成途径也有差异，这正是微生物代谢多样性的一种表现。用于PHB生物合成的碳源有糖类、有机酸（乙酸、丁酸等）、甲醇、二氧化碳等多种含碳化合物，这些碳源在细胞内通过各种代谢途径转化为乙酰辅酶A (CH3Co~SCoA)，在微生物细胞内乙酰辅酶A积累过剩时将转变成PHB。 Peoples, O. P.等在对真养碱杆菌、拜氏固氮菌等许多细菌的研究中发现，PHB是从乙酰辅酶A通过三步反应合成的，即通过三酶途径合成。三酶即b -酮基硫解酶（乙酰辅酶A乙酰转移酶）, 催化两个乙酰辅酶A的C—C结合； 依赖NADPH的乙酰乙酰还原酶（羟基丁酰CoA脱氢酶), 催化立体选择性的反应，从乙酰乙酰辅酶A产生D(-)-3-羟基丁酰辅酶A；PHB聚合酶，它将各D(-)-3-羟基丁酰辅酶A部分通过酯键连接成聚酯。 PHB是一种热塑性塑料，其物理性能与聚丙烯很类似。例如：熔点、玻璃化转变温度、结晶度、抗张强度等（见表4-1）。PHB除了具有高分子化合物的基本性质如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，还有它特有的性能，如压电性（结晶结构不对称导致压电性），可作音响设备的薄膜；手征性，可以作为光学活性物的来源。然而PHB优越于大多数化学合成高分子材料的最突出性能是PHB优良的生物相容性和可生物降解性，这是许多化学合成塑料所不具备的。因此，PHB在医学、药物、工业、农业等领域应用更有其独特的优点。 表4-1 . PHB和聚丙烯（PP）的性质
首先，PHB具有生物降解特性，并由于它有热塑性，能沿用通用的加工方式,如注塑成型、纺丝、成膜等，因此可制成容器瓶、袋、薄膜等各种一次性包装材料，它的废弃物在生态环境中分解为CO2和H2O，不污染环境。第二，PHB具有良好的生物相容性，可作为医用高分子材料在医学、药学领域获得广泛应用。如可作为外科缝合线及长效药物控制释放体系的载体，还可作植入体内的固定材料（肘钉、拭子）。PHB还可用作伤口敷料、血管替代品、骨骼替代品或骨板，术后无需取出。用PHB还可制成医用手套、包扎材料、止血塞、医用薄膜等医疗用品。第三，PHB可用作农药及肥料的生物降解载体，如长效除莠剂，抗真菌剂、杀虫剂等。第四，PHB作为一种由微生物发酵合成的天然高分子材料，它不依赖于石油化工业，从长远观点来看，可解决石油危机导致的原材料紧缺。除了作为塑料外，由于PHB具有手征性，还可用于化学合成光学活性物质的手性前体，特别是合成药物和昆虫信息素。基于PHB特有的这些性能，目前有关PHB生物合成、改性及应用等研究异常活跃，成为生物材料领域中一个新的研究热点。 1925年法国的Lemoigne首先发现巨大芽孢杆菌（Bacilus megaterium)中存在PHB，并阐述了PHB是一种重要的细菌产物。1927年Lemoigne又首次从细胞中分离出了PHB。随后，人们发现，PHB广泛存在于自然界中的各种微生物细胞内，它可以作为微生物的碳源和能源的贮存物。在通常情况下，细胞内PHB含量很低，一般为1—30%。五十年代末，人们研究了生长条件对生物体内PHB代谢的影响，发现微生物细胞内PHB生成的量随培养基中碳氮比的增加而增加，即PHB的积累是在某种营养物受限的不平衡生长条件下发生的。这是一个重要的发现。七十年代，人们又发现，控制氮源、氧气压力和矿物离子浓度等条件均可使细菌细胞内积累PHB。用于PHB积累的碳源包括二氧化碳、甲醇、乙酸、丁酸、果糖和葡萄糖等。碳源的不同会引起生产工艺以及产品性质的差异。自此，人们可以通过控制微生物发酵条件来合成PHB，使PHB在细胞内的含量大大提高，如真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus)在一定条件下积累PHB可达细胞干重的90%以上。 1974年Wallen观察到微生物能合成聚羟基丁酸共聚物，而且它较PHB均聚物有某些更好的特性，1983年De Smet发现用烷烃类作基质可产生不同碳链长度的聚羟基烷酸。此后，有关PHB合成的工作越来越多。 目前，对发酵生产PHB的研究已成为一项热门课题，一些国家已进行了细菌发酵PHB的工业化生产。英国ICI(Imperial Chemical Industry)公司居于领先地位。ICI使用真养产碱杆菌突变株以葡萄糖作碳源生产PHB，用磷酸盐消耗作为限制生长因子，采用两步法进行生产。第一步使菌体充分生长，在生长停止时（约60小时）再加葡萄糖使PHB大量积累，总时间约110—120小时，PHB达细胞干重的75%。从细胞中提取聚合物是决定生产成本的重要因素之一。ICI使用过甲醇回流除去脂类和磷脂，再用氯仿或二氯甲烷提取，冷却沉淀PHB最后真空干燥的方法。为降低成本，ICI公司开发了非溶剂处理方法，并投入工业应用。 奥地利的生物技术研究有限公司（btF biotechnologische Forchungsgesellschaft m.b.H.)和林兹化学有限公司（Chemie Linz AG)等中试规模生产PHB，他们使用肥大产碱杆菌，该菌的特点是在对数生长期积累PHB，利用蔗糖在15m3发酵罐中年产PHB 20吨，产物为白色无味粉末。 我国关于PHB的研究起步较晚，但也受到重视，列入八五攻关项目之中，研究工作已取得了很大进展。中国科学院微生物研究所和中国科学院有机化学所的研究人员用真养产碱杆菌、肥大产碱杆菌、褐色球形固氮菌、假单胞菌等利用不同碳源产生PHB的研究也取得了可喜的进展。以查氏生丝微菌成都亚种(Hyphomicrobium zavarzinii subsp. Chengduense subsp. nov.)利用甲醇为唯一碳源合成PHB，在10升罐中产率为0.64g PHB/L/h，PHB占细胞干重40—59%。1987年李祖义等从土壤中筛选出的假单胞菌，经适当培养，细胞中积累的PHB量可达细胞干重的30.4%；1991年徐浩等选育出肥大产碱菌，产生的PHB经提纯后其纯度与Sigma产品一致，产量占细胞干重的23.9%。陈琦等采用常规紫外线诱变处理真养产碱杆菌H16，获得高效利用葡萄糖产PHB的突变株，PHB积累量达10g/L。另外，中科院微生物所周培谨研究小组以极端嗜盐菌为菌种，以廉价的农副产品作为底物，进行发酵生产PHB，提高其转化率，简化了分离过程，降低生产成本，可望为PHB的工业化生产打下基础。 八十年代后期，人们提出了将重组DNA技术应用于生物合成PHB的领域。Schelegl等发现，真养产碱杆菌有b -酮基硫解酶参与缩合反应，该酶受游离辅酶A强烈抑制。因为天然来源的PHB聚合酶很难纯化，Peoples 等分离出基因，以便研究酶学机制和PHB代谢调节。在生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)和真养产碱杆菌H16中，b -酮基硫解酶基因(phbA)和依赖NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因(phbB)紧密相连。用真养产碱杆菌H16负向突变株互补方法确定，phbC基因编码PHB生物合成途径中的第三个酶—PHB合成酶。由此， PHB生物合成途径中三个酶的顺序应该是phbC—phbA—phbB, 它们有一个共同启动子位于上游。于是，有三个实验室独立地将真养产碱杆菌H16的PHB生物合成基因按phbC-phbA-phbB顺序在大肠杆菌中表达，其结果PHB产量可达细胞干重的50%。 一些研究人员用Cosmid pVK102构建H16基因库，编码PHB合成途径的Cosmid克隆则通过测定3-酮酯酶活力来筛选，然后进行亚克隆实验，得到5.2Kb的KpnI-ECoRI片断，再将其克隆在大肠杆菌中直接合成PHB，其PHB产量可达菌体干重的80%。还有一些研究者先分离转座子诱导的H16不产PHB突变株，将其带有Tn5—mob的ECoRI片断克隆并用作鉴定入L147基因库中各个完整基因。他们得到的重组菌产PHB的量为细胞干重的30%。其后，又有十几个不同细菌的PHA合成酶基因克隆成功。 无关联的细菌之间能够转移生物合成基因的事实为PHB的生物合成开辟了一条新路。人们可以利用易大规模培养的、过量产生酶的重组菌来生产这类生物聚合物。这方面研究的最终目的是为了扩增编码关键酶的基因来设计并控制合成新的聚合物的生物合成途径。近年来已将真养产碱杆菌的PHB生物合成基因在食油假单胞菌中克隆，得到的重组菌株能表达真养产碱杆菌的PHB的合成基因。 将真养产碱杆菌PHB合成酶基因在欧文氏菌（Ervrinia sp.) 中表达。重组菌能利用淀粉和多种单糖、双糖、糖醇、糖酸和糖苷等。在5升发酵罐中培养35小时，利用蔗糖菌体干重达28克/升，干菌体的PHB含量为68%。 带有真养产碱杆菌PHB生物合成基因的重组大肠杆菌XLI-Blue在2.5升发酵罐中分批补料培养42小时，细胞干重达每升116.6克，PHB浓度为88.8克/升，这是迄今报道的单位时间产率的最高记录，它显示了重组DNA技术可应用于生物合成PHB领域的巨大潜力。 奥地利科研人员为使PHB能释放于细胞体外，在构建“工程菌”的同时，插入噬菌体热敏溶解基因，使 “工程菌” 易于裂解而释放出全部PHB，这样简化了提取时所要求的苛刻条件及工艺，降低了成本。因此利用基因工程菌生产PHB有相当大潜力。 组建“转基因植物”生产PHB的研究也取得突破。美国、奥地利合作已将真养产碱杆菌的PHB合成基因转入到芥科植物、胡罗卜、甜菜以及粮食作物土豆、玉米植物中获得表达，试图使这些转基因植物像合成淀粉那样生产PHB，为可生物降解塑料的生产开辟新来源。 对于PHB的生物降解，国外从60年代起陆续开展了研究，直到90年代初期才有比较系统的工作发表。而在我国至今末见到有关降解方面的工作报导，热点仍然在PHB的生物合成上。国外开展的工作主要有以下几方面： （１） 菌种筛选 兰氏阳性和革兰氏阴性的好氧细菌都有降解PHB的能力，许多真菌也具有降解PHB的能力，关于厌氧微生物是否能降解PHB到目前还没有报道。现在已分离到的能降解PHB的微生物已有数十种。从已分离到的菌种来看，其中有90%是90年代以后分离出来的，由此可见关于PHB生物降解的研究从九十年代初开始引起人们极大的兴趣，使之成为一个新的研究热点。 （２） 酶的分离纯化及降解机理的研究 一些科研人员从莱蒙氏假单胞菌(Pseudomonos Lemoignei)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis T1)、Penicillium funiculosum和Pseudomonees Pickettii 等菌中分离PHB解聚酶，并利用聚丙烯酰胺凝胶电脉等方法测定了酶的分子量、最适pH和等电点等。通过核磁共振的氢谱(1H-NMR)等方法测定水溶性水解产物得知，不同的酶降解机制不同，有些酶从羟基端开始降解，有些酶从羧基端按次序降解。不同的酶降解产物也不同，有单体、二聚体、三聚体等。 （３）分子水平方面的工作 T. Saito等人从Alculigenes faecalis T1中得到PHB解聚酶基因，并已克隆到E. Coli DH1中，并得到表达。通过对纯化的蛋白质顺序的分析得知，此酶由488个氨基酸组成，信号肽由27个氨基酸组成。 D. Jendrossek等人1995年对PHB解聚酶系统的生物化学和分子结构进行了表征，他们发现，Pseudomonas Lemoignei有5个不同的解聚酶基因，它们 分别编码5种不同的解聚酶，并对基因的分子组成和结构进行了研究。 随着塑料制品的广泛使用和人们对环境污染问题的日益重视，开发利用可生物降解塑料已势在必行。PHB作为一种新型的可生物降解高分子材料具有广泛的应用前景。今后PHB研究的发展应着眼于：（1）应用DNA重组技术选育PHB高产菌株，提高PHB产量；（2）进一步进行发酵工程的研究，有效地解决高效培养问题，缩短发酵周期，改进提取工艺，提高产量和产率；（3）开发利用价格低廉、来源广泛的农副产品作为原料生产PHB，降低生产成本；（4）在开发PHB生物合成和应用的同时，研究其生物降解特性，为PHB的应用奠定理论基础。 |