Untitled Document

　　外植体（explant）：植物的外植体是指用于遗传操作的植物的某一器官或部分，通过离体组织培养可以再生成完整的新植株，在转基因实验中用于作为外源基因转入的受体。因为各种植物本身的特点，用于作为外植体的植物部分有很大差异。自转基因工作以来，人们采用过：幼花穗，幼叶、子叶节，叶盘，幼芽生长点，成熟种子胚，未成熟种子幼胚，花粉及小胞子及来源于植物幼嫩组织的原生质体等大部分植物的器官。由于植物细胞具有全能性的特点，上述作为外植体的一部分植物细胞，在适当培养基、激素和一定温度光照条件下，可以发育成完整的新植株。它们都可以作为植物转基因的受体进行转基因遗传操作。因为不同植物的不同外植体对组织培养的反应不同，以何种外植体作转基因受体，有很大区别。需要根据各自的目的进行试验，以选取最佳的转化受体系统。

　　In plant transformation：这是一种不用组织培养的植物转化途径。长期以来，人们一直致力于寻找不用组织培养的植物转基因体系，这样可以避免采用费工、成本高、效率低的依赖于组织培养的转化方法。尽管科学工作者作了大量探索，但至今成功的例子不多。大多数这类工作是在植物的合子形成前后进行试验的。这是建立在植物进行授精时卵细胞可能更容易接受外来基因的假设，而实现将外源基因转入目的植物。这一设想已经在拟南芥菜（Arabidopsis）的转基因实验中得到了证实。在拟南芥菜中是在开花时将外源基因接触到花器上实现将基因转入拟南芥菜的合子，获得转基因的种子。此外，在国内广为应用的花粉管通道法、子房注射、将花粉与外源基因溶液混合然后授粉、及用干种子直接吸收DNA溶液等都是不用组织培养的植物转基因方法。有关其中的主要方法将在下面进行详细介绍。很显然，不用组织培养的转化途径将给植物转基因带来很多优点，是近几年科学工作者在转基因方法上探索的主要问题。

　　2、外源基因的制备

　　转基因的基因来源可以是植物，也可以是动物或微生物。为了获得高水平的表达效果，要将目的基因进行重组改造，以适应植物转基因工作的需要。通常是将分离出的目的基因整合到某个载体上，转化大肠杆菌或农杆菌。转入农杆菌的外源基因通常直接用农杆菌转化技术进行遗传转化；采用基因强转化技术，需要将含有目的基因的大肠杆菌进行培养，然后制备大量目的基因，用于转化实验。高效表达载体的构建，启动子、增强序列的选择、载体和菌种的不同，都对转基因的最后结果产生重要影响，这里不作深入介绍。

　　３、筛选

　　植物转基因实验过程中，不论采用那一种技术。常常只能转化植物外植体的一部分，或是组织的一小部分，或是细胞群体的一小部分。要使已经转入外源基因的这部分组织或细胞发育成完整的纯合转化体，都要对经过遗传转化的群体进行筛选，使转入外源基因的组织或细胞在选择压力下正常生长发育，而抑制未转化部分的生长，直到死亡。选择的基本原理是使未转化的组织或细胞，在含有选择剂的培养基上新陈代谢受阻而停止生长，最后死亡。选择剂通常为抗生素或杀草剂。选择过程一般为3-4个周期，每个周期为3-4周。因为为选择过程是一个慢性致死过程，在第一次选择时，转化与未转化细胞均能生长；将第一次选择过的愈伤组织分成小块，转到新配置的培养基上进行第二次选择，在本次选择后期可以看到明显差异，有的生长正常，有些生长缓慢，生长正常的愈伤组织即含有转化的部分；将第二次选择结束时生长正常的愈伤组织分成小块转到新配置的培养基上进入第三次选择，此时来源于同一愈伤组织的若干块愈伤组织若全部生长正常，表明它们已是纯合的转化体，选择到此结束，将这些纯合的转化体转到分化培养基进行植株再生。再生培养基上是否仍然含有选择剂根据抗性愈伤组织的数量而定，以获得足够数量的再生苗为原则。如果再生苗数量大，在再生培养基上可以继续加选择剂；如果抗性愈伤组织的数量小，为安全考虑，可以不加选择剂。选择压力即选择剂的用量和选择周期的设置，因不同植物、不同外植体和不同基因型等因素而不同，应当通过预先实验并参照其他实验室的报导来确定。

　　4、鉴定

　　对转基因实验获得的抗性再生植株（或愈伤组织）需要进行分子生物学和生物学功能的鉴定。

　　分子生物学鉴定将提供转基因后的植物组织或再生植株外源基因存在与否、基因拷贝数及表达水平等。PCR、Southern hybridyzation、Northern hybridyzation、ELISA、Western immunoblot等分子生物学技术经常用来进行转基因植株的鉴定。

　　Polymerase chain reaction(PCR)技术是最常使用的分子生物学技术之一，可以对大量样品进行初步检测。但值得注意的是PCR鉴定的阳性结果，只说明在被检测的样品中含有与PCR引物非常相似的同源DNA序列，不能说明模板DNA是来源于样品还是其它污染；也不能说明检测到的DNA序列是否整合进被转化植物的基因组。尽管如此，PCR技术仍是人们检测转基因植物分子生物学鉴定的第一步，并广泛用于对转基因当代筛选和后代分离比例的分析。用PCR技术检测转基因植物样品时与克隆基因不同。应当使PCR产物不超过1000 bp，引物要长，在25-30核苷酸，退火温度要高，在65-68℃左右，以保证PCR反应的高度特异性。Southern hybridyzation技术可以确定外源基因是否整合在基因组上及转入外源基因的拷贝数。此方法比PCR检测结果可靠，但耗费时间和物力。一般是用PCR技术先初测，PCR检测阳性样品，再用Southern hybridyzation技术进一步检测，以最后确定外源基因转入状态、整合状态和基因拷贝数量。Northern hybridyzation技术是用来检测外源基因表达状况的方法。ELISA和Western immunoblot是用抗体检测转入基因蛋白产物的技术。可以对蛋白产物进行定性和定量检测，敏感度高。ELISA技术简单易于操作；Western immunoblot虽然步骤多，但能得到关于蛋白产物大小的信息。

　生物学功能鉴定

　　是对导入的外源基因应当表达的生物学功能的检测。分子生物学鉴定只能给出外源基因是否转入获得的植株中及其整合状况和拷贝数，并不能由此得出生物学功能的信息。因此对转化植株有必要进行是否具有已转入基因的生物学功能的鉴定。比如转抗虫基因的玉米，应当用转化植株及其叶片进行杀虫效果的试验；转抗白粉病的水稻植株应当用白粉病的病源菌对转化植株接种，然后观察抗病效果。总之，转化植株生物学功能的测定以转入外源基因预期的功能来设计检测方法，对获得的转基因植株进行评价。

　　遗传学鉴定

　　遗传学鉴定包括两部分：遗传稳定性和转化植株后代的分离比例。遗传稳定性的鉴定一般是对转入的外源基因在以后的5-6代中进行跟踪，以确定转入的外源基因在转化植株中是否能稳定的传递给后代。常常用分子生物学的方法如PCR技术，对后代进行分析。转化植株后代基因分离比例的检测可以提供转入的外源基因整合信息，如果呈3：1分离，说明外源基因是符合染色体遗传的单基因，15：1可能是同时转入2个拷贝基因的染色体遗传。由遗传学鉴定获得的信息，将使我们从转化群体中选出能够将外源基因稳定传递具有单拷贝的个体，它们才是在生产中可能有用的转化体，进入育种序。

　　二． 外源基因导入植物的主要方法

　　自从人们探索植物转基因以来，曾经尝试了大量的不同方法和技术，任何一个有效的转化体系需要满足下述条件：

　　受体组织可以离体再生或扩繁；有效的转入基因的方法；筛选转化组织的选择系统；获得可育转化植株频率；简单、有效、可重复、不依赖基因型以及成本低；离体组织培养的时间短，以减少体细胞变异和不育株比例。

　　为了以较少的代价获得大量转基因植株，人们尝试了各种技术，以获得大量转基因植株。尽管试验了众多方法，但近年来应用最多效果较好的方法主要有：农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、整体转入法等技术。下面就这些主要方法做以介绍。

　　1、农杆菌介导法

　　有两种农杆菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌(A. Rhizogenes)被广泛用于植物转基因。早期的双子叶植物的转基因工作主要是采用这一方法进行的。1994年以后，由于乙酰丁香酮及其类似物的发现，农杆菌介导介导法又在单子叶植物中获得了突破性的进展，使这一方法得到更为广泛的应用。

　　早在本世纪初Smith 等人就发现作为自然存在的遗传工程，土壤中生存的根癌农杆菌可以将外源基因转入植物而导致根肿瘤的生成。农杆菌的致病基因在酸性条件和酚类诱导物（如乙酰丁香酮）的存在下，微生物DNA分子的一部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中。这类酚类诱导物是大多数双子叶植物在受到伤害时产生的。在植物转基因早期阶段，由于农杆菌转化系统即简单又不需要很多仪器设备，就成为很多科学工作者首先研究的热点。1977年Chilton等人证明根癌农杆菌的Ti质粒的一部分转入植物细胞，整合进植物基因组使植物产生肿瘤。农杆菌转入植物的DNA片段称为转移DNA（T- DNA）。Ti质粒可以将外源基因转入植物的能力引起人们的广泛兴趣，早期的植物转基因工作既是用它作为植物转基因的载体，进行大量转基因研究。

　　Ti质粒是农杆菌细胞核外的双链环状DNA分子，长度约200 kb，其中致病区（Virulence gene）和T- DNA边界序列是Ti质粒将外源DNA片段转移到植物细胞所必需的两个序列。

　　T- DNA边界序列：在T- DNA的两端边界各有一个25bp的正反重复序列，在不同的T- DNA中，此片段是高度保守序列。插入这两个边界序列之间的外源DNA序列，就有可能被转移到植物基因组中。

　　致病区（Vir）：目前已经鉴定出6个农杆菌的致病区（VirA, VirB，VirC, VirD,VirE,VirF和VirG）。它们需要在植物细胞释放的信号因子激活下才能表达。目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子，而使T- DNA可以成功的转入；而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的基因，达到转基因的目的。

　　农杆菌介导法目前以根癌农杆菌使用的较多，尤其在早期的双子叶植物的遗传转化研究中上发挥了重要作用。近年来人们对农杆菌介导法机理作了深入研究，发现了酚类化合物在外源基因导入植物细胞的作用。尤其是日本烟草公司的Hiei等人在水稻遗传转化上应用农杆菌介导法获得了明显的进展，使这一转化方法在单子叶植物中也有了成功的应用。农杆菌介导法与其它方法比较，具有转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高并可以转入大的DNA片段（可达150 kb）、不需贵重仪器等优点。

　　在双子叶植物的转化研究中，可以用植物的叶片、幼茎、悬浮培养物、及发芽的种子等作为外植体进行农杆菌转化试验。在进行农杆菌转化试验中常常要对不同的农杆菌菌株、农杆菌和植物外植体共培养的时间和温度及选择压力进行优化，以获得更高的转化效率。根据Escudero等人研究结果，在自然条件下农杆菌可以渗入植物细胞，因而在作农杆菌转化时，没有必要对植物组织制造伤口。超声波予处理植物组织，可以提高转化效率。在用农杆菌进行葡萄转化试验时，用抗氧化剂如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或二硫苏糖醇处理可以提高转化效率。

　2、生物弹或粒子枪（Biolistics or Particle gun）基因转化技术

　　此项技术是1987年由Klein首先使用于玉米的转基因工作，此后迅速广泛的应用在转基因研究工作中。它的基本原理如下。将外源基因附在重金属如钨或金颗粒上，然后在一个真空的小室中采用高压将带有基因的金属颗粒轰击进入植物组织或细胞，少数基因将整和到基因组中，获得表达并可能传递给后代。在真空的小室中，依靠火药爆发、氦气、二氧化碳或放电，使金属颗粒获得高速。目前以美国伯乐公司（Bio-Rad）的PDH1000型基因枪应用最为广泛。经过一些技术环节的优化，可以大大提高转化效率，比如对外植体予培养、在植物组织被轰击前加挡网、采用小颗粒子弹及渗透压处理等。轰击后的植物组织经过大约3-4次选择，得到的抗性培养物然后再生为转基因的新植株，进入分子生物学和生物功能的鉴定，从中选出优良转化株进入育种程序。

　　此种方法也常称为基因枪法，它有以下优点：

　　操作容易；一次轰击可以转化大量细胞；几乎任何植物组织或细胞都可以使用基因枪进行转化；转入组织的深度可以用轰击压力和空间距离来控制。因此，基因枪技术出现后，大大的促进了转基因理论研究和产业化应用的进程，尤其在进行转化方法的优化、构建质粒的测试、特异启动子的功能等方面发挥了重要的作用。

　　生物弹转化技术的缺点是转入的基因拷贝数是随机的，常常多于一个拷贝，使导入的外源基因表达水平降低或沉默；此外还容易将较大片段的基因断裂成小片段。

　　３、原生质体转化途径

　　植物原生质体分离和培养技术在过去的20年来，在大量植物中获得了成功。由于原生质体培养系统可以提供大量的单细胞，所以在植物转基因的初期，很多实验室试图以原生质体作为转化受体体系，来进行转基因试验。聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）具有改变细胞原生质膜通透性的作用，很早用于进行细胞融合实验中。1982年Krens等人首次用PEG处理烟草原生质体获得了转化植株，开拓了用PEG进行植物转化的新途径。采用机械或酶处理技术可以从未成熟胚、幼穗、叶肉、叶盘和花药等植物组织分离原生质体，然后用于遗传转化实验。农杆菌、PEG及直接吸收DNA法都可以用来进行原生质体转化。以原生质体培养体系作为转化受体体系除需要良好的分离制备原生质体的技术外，转化后的原生质体还要有良好的再生能力。原生质体离体培养再生技术对于大多数植物来说是很困难的，到目前为止还只在少数植物的个别基因型上获得过成功。因此，尽管此法转入外源基因比较容易，但原生质体的分离和培养是相当困难的，所以，此方法的应用只限于少数实验室。但是，最近Hall 等人用甜菜的气孔保卫细胞分离出的原生质体成功的建立了以原生质体为受体体系的转化系统。Hall等人将此与以胚性愈伤组织和子叶为外植体的甜菜转化系统进行了比较，发现气孔保卫细胞分离出的原生质体的再生能力可能与基因型无关。这可能也为其它不易转化的植物提供一条新路。

　　4、花粉管通道法

　　这是一个主要由我国科学工作者发展起来的植物转基因技术。早在70年代末，上海生物化学所的周光宇等科学家将从植物提取的总DNA在开花前后加到受体植物的柱头上，在受精的同时，外源DNA经过花粉管与花粉一起进入合子。在新的合子中携带有外源DNA。20余年来，我国科学工作者通过花粉管通道技术创造了一大批新型育种材料，有些并获得了新的商业品种。花粉管通道法是一个不依赖于组织培养的将外源基因转入受体的简便技术，易于为广大育种人员进行操作。

　　花粉管通道法由于缺少分子水平上的机理研究报告及证据，目前争议较大。随着对其转化机理的深入研究及提供有力的分子生物学的实验结果，人们将会统一认识，进一步发挥这一方法在植物转基因方面的应用。

　　5、拟南芥菜（Arabidopsis）的转化方法

　　拟南芥菜因为染色体组小、生活周期短等特点被很多实验室用来作分子生物学和转基因实验的模式植物。大量的植物基因及突变体不断的从拟南芥菜中被分离鉴定出来。拟南芥菜的遗传转化方法非常简便，别具特色。在拟南芥菜的开花盛期，将花序倒浸于含有目的基因的农杆菌液中，真空条件下处理数秒钟，然后将处理过的植株移到正常生长条件下，让植株结实。其中有一部分种子被转化。将收获的种子用适当的筛选剂如抗生素、杀草剂等进行筛选，即可获得阳性转化植株。用此方法一般可以得到千分之几的转化频率。尽管转化效率不高，但操作容易，重复性好，已经在很多实验室广为采用。最近几年，更将拟南芥菜的转化方法发展为用农杆菌液直接喷在开花期的花序上，同样可以获得转化植株。应当指出的是，在拟南芥菜上行之有效的简便转化方法，也应当可以在其它植株矮小的植物上可行。

　　6、整体转入法（in plant transformation）

　　人们一直在探索不用组织培养的遗传转化技术，因为依赖于组织培养的转化方法难度大，费用高，还有很强的基因型的制约。在很多植物上如玉米、大豆、小麦等还局限于少数有限的基因型，它们常常是一些没有经济价值的实验材料。用它们作转化受体材料，还要进行回交转育。如果直接用有生产意义的基因型，常常存在转化效率低的问题。

　　在本节4中介绍的花粉管通道法就属于这一类型。与此类似的如子房注射法。还有将外源DNA与花粉直接混合，然后对柱头进行授粉；将干种子放于DNA溶液中直接吸收法；用基因枪轰击花粉然后进行授粉等方法。但目前这些方法还不普及，可重复性不高，也需要有力的分子生物学的证据。

　　此外，如超声波法、硅化纤维法、脂质体介导法、电泳法、大量注射法、电激法、激光转化法等都有过尝试，但由于这些方法可重复性不高、转化效率低等原因，没有广泛应用于植物转基因工作中。

　　三．用于植物改良的外源基因

　　理论上任何可以提高作物产量、抗性和品质的基因都在用于或将要用来改良植物，使它们更好的为人类提供营养价值高的食品。目前人们已经用于转化的目的基因主要有以下几种。

　　1、抗虫害基因的利用

　　害虫每年为农业生产造成重大危害，使农产品的产量和质量受到严重经济损失。人们在一开始就对抗虫基因的转移作了不懈的努力。到1998年，已有大约40多种不同的抗虫基因转入作物。商业化的抗虫转基因作物已经在生产上开始应用。转基因的抗虫作物与靠化学药剂防治害虫的常规作物具有防虫效果好、有利于环境保护和降低生产成本的优点。

　　（１）来源于微生物的抗虫基因

　　Bt基因是从生活在土壤的微生物苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)分离出来的。它可以产生抗虫的结晶蛋白，称为Bt毒素。自从1950年以来人们就用Bt毒素生产杀虫农药。当昆虫食入Bt毒素后，在蛋白酶的作用下Bt毒素被激活，与肠胃表皮受体结合，插入膜上，导致昆虫体内电荷、钾离子和pH值异常，最终使昆虫肠胃穿孔，而杀死害虫。这些毒素基因因为都能产生结晶蛋白统称为结晶蛋白基因，目前已经已经从苏云金杆菌中分离出40多个生产不同Bt毒素的基因，根据蛋白的不同结构等，将它们分为cryI, cryII, cryIII 和cryIV四大类，分别对鳞翅目和鞘翅目昆虫有杀伤作用。目前已经将Bt基因转入26种植物并得到了表达，其中在生产上影响较大的有美国孟山都抗玉米螟的“保丰”玉米和孟山都及中国农业科学院郭三堆的抗棉铃虫的棉花等，在生产上发挥了重要作用。

　　（２）来源于高等植物的抗虫基因

　　目前主要有两类植物来源的抗虫基因已经用于植物转基因的工作中：消化酶抑制剂（包括蛋白酶和淀粉酶抑制剂）和凝集素基因。

　　蛋白酶抑制剂基因

　　植物蛋白酶抑制剂是植物本身天然的抗御食草动物的防卫系统。昆虫中的蛋白酶如丝氨酸、半光氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶是消化它们食入的氨基酸而获取营养的蛋白。将这些蛋白酶抑制剂转入植物，在昆虫食入这种转基因植物后，它们的蛋白酶将被抑制，使它们不能获得足够的营养而达到杀死害虫的作用。现在已有大约14种蛋白酶抑制剂基因转入植物获得了抗虫能力，包括来源于大豆、大麦、菠菜、豇豆、水稻、马铃薯、西红柿和芥子等植物的种子和块茎，其中豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）效果最好，已经转入十几种植物。与Bt基因相比，蛋白酶抑制剂基因的抗虫效果低，目前还没有用蛋白酶抑制剂基因实现产业化的作物品种推出。

　　淀粉酶抑制剂基因

　　有3种淀粉酶抑制剂基因被转入烟草。它们可以与昆虫的淀粉酶形成复合物而抑制其活性，达到阻碍鞘翅目和鳞翅目幼虫生长的作用。

　　凝集素基因

　　凝集素是碳水化合物结合蛋白，在很多植物中存在少量凝集素。有些植物凝集素对同翅目、鞘翅目、鳞翅目和双翅目害虫有毒性。值得注意的是有些植物凝集素也对哺乳动物有毒性，如P. Vulgari,卫豆、大豆和小麦。豌豆和雪花莲的凝集素是无害的，因此大家主要用这两种做转化试验。近年来利用较多的为雪花莲凝集素基因（GNA），它可以有效的抗蚜虫和水稻brown planthopper.

　　目前，大量抗虫物质(主要为蛋白类物质)从植物正在被大规模的筛选、鉴定、分离、纯化出来，并克隆相应基因，将为抗虫基因工程提供更多可以利用的基因，以提高植物的抗虫能力。

　　（３）来源于动物的抗虫基因

　　一些动物可以产生杀虫物质。人们已经从蝎子分离出抗虫基因，并正在进行转基因抗虫试验及对人、蓄的安全进行研究。从动物分离的基因目前主要为一些蛋白酶抑制剂基因和几丁质酶基因，人们已经将它们转入烟草植株，具有一定的抗同翅目、鳞翅目和直翅目害虫的作用。

　　2、抗病基因工程

　　随着分子生物学的不断发展，一大批与抗病有关的基因被陆续克隆出来，使人类可以用基因工程技术创造抗病的转基因植物，包括病毒病害、细菌病害和真菌病害。

　　（１）抗细菌和真菌病害的基因工程

　　自然界很多植物自身存在抗病基因（resistant gene, R-基因）。可以将它们分离出来，然后转入不抗病的品种中，以获得转基因抗病植物。

　　植物在外来病原菌侵入时自身有防御体系来对付病原菌。这些与防御有关的基因会诱导产生一些拮抗物质，阻止病害的发生和蔓延。与防御系统有关的基因如几丁脂酶基因、葡聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因、植物保卫素、病原相关蛋白基因等。将这些基因转入植物，可以在一定程度提高植物的抗病力。

　　还有一些非植物来源的抗细菌蛋白，它们是许多动物如节肢动物、两栖动物和哺乳动物抵抗微生物的物质成分。

　　来源于昆虫的裂解肽（lytic peptide）是一种亲水的螺旋结构的小分子蛋白，其作用机制是在细菌的膜上形成孔道，如从大蚕蛾中分离出来的杀菌肽（cecropin）已经转入马铃薯和烟草植株并得到抗病植株。

　　溶菌酶（lysozyme）是广泛存在于自然界的酶，能特异性的水解细菌细胞壁的肽葡聚糖。转鸡卵溶菌酶基因的烟草植株可以抗几种细菌病害。

　　乳铁蛋白是一种具有抗细菌能力的铁结合蛋白，在植物体内修饰后产生的短肽具有很强的抗细菌能力。

　　向植物转入抑制细菌致病力或有毒因子的外源基因也可以达到提高植物抗细菌病害的目的。这一类基因可以来自细菌或其它微生物。在植物中转入病原菌的单克隆抗体的基因，也已成功的用于抗病害的基因工程。此外提高植物自身自然抗病防卫能力也是一个可行的抗病基因工程策略。在马铃薯的转基因植株中转入了激发子（elicitor）基因，提高了植株的抗病能力。提高转基因植株活性氧的水平，可以通过诱导致病区细胞死亡、直接对致病原产生抗性和导致细胞壁增厚等提高植株抗病性。人工诱导感病部位细胞程序化死亡也是一种抗病途径。

　　（２）抗病毒病害的基因工程

　　病毒病也是植物的主要危害之一，在很多豆科和茄科作物上危害尤其严重。早在二十世纪初科学家发现病毒具有交叉保护现象。利用这一原理，人们作过抗病毒病的尝试，并获得预期效果。转基因技术的发展，利用这一原理人们开展了大量的转病毒部分基因组的转基因工作，使植物病毒病的防治，在新的层次上有了大大发展。

　　1985年Beachy等将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因转入烟草细胞，转基因后代植株显示了对TMV的明显抗性。从此用转基因技术为抗病毒病开辟了一条新途径。此后，人们陆续将苜蓿花叶病毒、马铃薯花叶病毒和大豆花叶病毒等外壳蛋白基因转入西红柿、马铃薯、苜蓿和大豆细胞中，获得的转化植株都在不同程度表达了对花叶病毒的抗性。

　　随着利用转病毒外壳蛋白基因获得病毒病抗性植株的普遍应用，人们发现，并不一定总可以得到预期的结果。如转黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的植株，当它们在田间遇到高温时，失去了抗病毒的能力。人们又进行其它途径的探索。利用病毒的运动蛋白基因、复制酶基因和卫星RNA等进行基因转移，期望获得抗病毒的结果。另一条途径是利用非病毒来源的基因，达到抗病毒病的目的。例如采用转入病毒的反义RNA、植物编码的抗病毒基因等其它策略获得了抗病毒的转化植株。1993年Taladoraki等人采用转入编码病毒单链抗体基因的策略，获得了对洋蓟皱叶病毒的抗性。随着抗病毒病害的基因工程的深入发展，正在向广谱抗病毒的方向进行探索。为实现这一目的，人们正在以下3方面进行努力：深入研究病毒编码的蛋白的功能，尤其是与复制和运动有关的蛋白及其基因；利用非植物来源的抗性基因包括抗体基因；深入研究植物体内自然存在的防卫系统，研究病毒-植物的相互作用，利用与这一防卫系统有关的基因。

　　3、抗除草剂基因工程

　　由于发达国家农业现代化的程度高，应用除草剂是适应大农业发展的主要手段之一，抗除草剂基因工程是这些国家的研究热点，尤其一些种子公司和农药公司，基于潜在的巨大经济利益的吸引，投入大量的人力和物力，促使转基因植物在抗除草剂基因工程方面成为进展最为迅速的领域，同时也获得了巨大的经济效益，在1997和1998年度的全世界转基因植物种植面积上抗除草剂作物分别占有63%和71%的比重。根据除草剂主要是通过破坏植物的氨基酸合成和光合作用的基本原理，人们通过分子生物学技术获得相关抗性基因，然后将这些基因通过转基因技术转入作物品种中。美国孟山都抗除草剂的玉米和大豆（Rounduo Ready Corn and Soybean）和棉花、加拿大比利时抗除草剂的油菜、德国艾格福的抗除草剂甜菜等抗除草剂作物陆续开发出来并投入生产。抗除草剂转基因作物因为减少农业用工、有效控制杂草，使农产品的产量明显增加，生产成本降低，提高了农业的综合效益。

　　最近，中国农业科学院水稻研究所黄大年教授所领导的研究小组，将抗除草剂基因用于获得高纯度水稻杂交种的研究中获得重要进展。他们将抗除草剂基因bar转入水稻品种，在田间施用杀草剂Basta将不含bar基因的假杂种杀死，从而保证了种子的纯度。

　　4、抗逆境植物基因工程

　　由于不利自然环境条件如干旱、低温、高温、盐碱、缺氧（水过多或土壤板结）、矿物营养缺乏、重金属毒害、污染及紫外线照射等每年为农业生产造成巨大的损失，提高植物抗御不良自然环境条件的基因工程，成为转基因研究的另一热点。随着分子生物学研究的进展，科学工作者对植物抗御逆境的机理在分子水平上不断获得新的知识，揭示有关的机理，并分离出与植物抗逆境的相关基因，使抗逆植物基因工程快速发展。但是，抗逆植物基因工程的进展尤其商业化应用，还有一定难度。这主要是由于植物抗御逆境的能力常常是一个非常复杂过程，还需要做大量的研究工作，以充分揭示机理；另外，这一过程常常是多基因参与的。目前这一领域的研究工作主要在抗旱、耐盐硷和耐低温等方面有一定进展。

　　5、品质改良基因工程

　　应用转基因技术进行品质改良主要集中在作物的淀粉含量及其组成成分、油脂含量和油脂成分，提高不饱和脂肪酸比例，以及改变脂肪酸碳链长度和提高蛋白质和必须氨基酸的含量等方面。

　　６、其它植物基因工程

　　高产植物基因工程研究是人们研究的热点之一。如通过提高光合作用效率、创造丰产株型主要包括矮化基因、控制分蘖基因等、抗衰老基因、耐低钾基因、耐低磷基因等，达到增产目的。利用新型基因及调控序列和花粉特异启动子，建立基因工程的雄性不育转基因植物配套体系，也引起人们的兴趣。

　　四、常用的标记基因和选择基因

　　在植物转基因研究工作中的标记基因（又称报告基因）导入植物24-48小时内就可以检测结果，迅速对转基因程序的有关因素进行评价和优化，获得基因表达水平、载体等信息。在植物转基因工作中常用的标记基因主要有CAT,GUS, Ant, Luc, GFP。

　　氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol acetyl transferase, CAT）基因

　　这是植物转基因研究早期使用的标记基因，因为CAT活性的检测费时，又需要放射性试剂，现在很少使用。

　　葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因

　　来源于大肠杆菌，是转基因研究以来应用最为广泛的一个标记基因。葡糖醛酸酶催化一些荧光和组织化学反底物的水解反应，生成非常容易观察的兰色产物。GUS的活性可以进行定性和定量分析，也可以在转基因的植物组织上进行定位分析，比如研究组织特异启动子。但使用GUS基因进行研究显色时所需的底物X-gluc费用较高，经过处理的组织丧失生活力。另外，使用细菌的基因来评价植物的转化效率得到的结果并不能真正代表植物本身的实际情况，只能作参考。

　　荧光素酶（Luciferase，Luc）基因

　　来源于火蝇的荧光素酶基因在ATP存在下催化D-荧光素的氧化反应生成氧化荧光素和黄-绿色光。这是一种对植物组织没有伤害的检测方法。缺点是观察所需的设备昂贵，荧光素酶检测底物对有些植物组织的渗透能力不强，影响实验结果。

　　花青素（Anthocyanins，Ant）基因

　　是来自于玉米、大麦和其它植物的与花青素合成有关的植物基因如C1, B, R and Ant. 转入这些基因后，可以在植物组织上生成红色的花青素斑点。此基因不需任何底物就可以检测，但使用局限性大，仅限于少数植物。

　　绿色荧光蛋白（Ggreen fluorescent protein，GFP）基因

　　绿色荧光蛋白是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，经过改造后用于做植物的标记基因，基因产物在兰色光或紫色光下可见绿色荧光，是最新发展起来的标记基因。因为它几乎克服了上述几种标记基因的所有局限性，因而尽管出现时间很短，已为普遍应用到转基因工作的各个方面。

　　常用的选择基因主要有除草剂基因、抗生素基因等。

　　Bar基因

　　是一种除草剂基因。它能产生一种谷氨酸的类似Phosphinothricin(PPT), 转入植物表达后产生的PPT 阻碍谷氨酰胺的体内合成，导致细胞内氨的积累而产生毒害作用，使植物细胞和组织停止生长，最后死亡。相应的选择剂为Basta 或Bialaphos。

　　Sulfonylurea（AHAS或ALS)基因

　　是另一种作为选择基因的除草剂基因。它的作用是抑制能够催化带分支的氨基酸如颉氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的乙酰乳酸合成酶的活性，使这些氨基酸合成受阻。相应的选择剂为Sulfonylurea 和Glean等。

　　抗生素基因

　　包括卡那霉素（Kanamycin）, Geneticin和潮霉素（Hygromycin B）等抗生素基因。卡那霉素（基因，nptII,neomycin phosphtransferase II ）与细胞器的30S核糖体亚单位结合，抑制RNA翻译的起始，Geneticin 的作用与卡那霉素一样，也用同一个抗性基因。潮霉素(基因hygromycin phosphotransferase,hph)可以与肽链延长因子EF-2作用，从而抑制肽链的合成。这里介绍的抗生素基因都来自于大肠杆菌。

　　甘露糖-6-磷酸异构酶（Mannose-6-phosphate isomerase，MPI)基因

　　这是1999年新近报道的选择基因。MPI是来源于大肠杆菌的manA基因。可以将不能为植物所利用的碳源6-磷酸甘露糖转换为可以利用的6-磷酸果糖。当在培养基中只有6-磷酸甘露糖作为唯一碳源时，只有含有MPI基因的转化组织或细胞可以生长，而未转化部分因为不能利用6-磷酸甘露糖而停止生长，直至死亡。这一新的选择基因，为植物转化提供了一个不用除草剂基因或抗生素基因来筛选转化植株的新途径，将对植物转基因领域产生巨大的推动作用，因为它可以使人们不再使用抗生素或除草剂来进行选择，大大的提高了转基因植物的可接受性。MPI基因在甜菜、玉米和小麦的遗传转化实验上获得了良好的结果。

　　此外，芬兰一个实验室为了在转基因植物中不含选择剂基因如抗生素或除草剂基因，以避免这些基因可能对环境或食品安全性带来任何不良影响，在大麦的转化实验中不用选择剂。实践证明，这种方法所进行的植物转化工作即使工作量大大加大，又很难获得纯合的转化植株，没有实际意义。为了在转基因植物中去除开始转入的选择剂基因，在一些实验室中采用两个策略。一是将选择剂基因和目的基因构建在两个不同的载体上，使它们随机插入到受体基因组的不同部位，通过将转化植株与受体亲本进行有性杂交的办法，可以在杂交后代筛选出不含选择剂基因的个体，达到除掉选择剂基因的目的。另一方法是在构建载体时在选择剂基因两侧加进特异序列，在获得的转基因植物上转入的选择剂基因被除掉。

　　五、作为生物反应器的转基因植物

　　在人类历史发展过程中，人们从植物获取了大量食品、纤维、建筑材料和药物等生活必需物质，植物为人类作出巨大贡献。自从DNA重组技术和植物转基因技术出现以来，植物为人类提供了更为广阔的应用情景。转基因植物作为生物反应器可以生产细胞素、激素、单克隆抗体、营养蛋白、酶、疫苗、各种生长因子及其它一些药物。与采用微生物发酵及动物细胞生产上述产品，转基因植物具有以下优点：植物细胞易于培养，操作简便，设备简单；生产成本低、易于后期提纯加工；安全性好，不容易被病毒或其它病原菌污染；转基因植物及其种子易于储存、运输；可以大规模生产。通过转基因植物生产疫苗因为成本大大降低，使原来不能广为应用的昂贵疫苗可以为更为广大的低收入人群所使用，尤其对更需要疫苗的发展中国家意义更为重大。在这些国家和地区，缺乏冰箱和其它必要条件来保存和运输疫苗。由转基因植物生产疫苗，尤其是食用疫苗，可能从根本上解决这些困难。科学工作者正在不断探索和改进作为生物反应器的转基因植物的原理和技术，一些生物技术公司投入更大的人力物力，开发产品。

　　已经用转基因植物生产乙肝疫苗、肠毒素B亚单位疫苗、链球菌表面蛋白疫苗和一些兽用疫苗等一大批产品。用转基因植物生产出的疫苗根据需要有的要经过提纯加工后使用，也可以直接用来做食品疫苗或家畜食用的饲料疫苗。早在1990年Arntzen小组就开始进行用转基因植物生产口服疫苗的尝试，抗御细菌引起的霍乱、腹泻。他们将相关基因转入马铃薯并得到了高效表达，并用小鼠进行试验，得到了预期的结果。进一步的试验将在香蕉上进行，带有疫苗的转基因香蕉将用来制作婴儿食品，实现生产口服疫苗的最终目标。英国Ma 博士等人正在研究用转基因植物生产由细菌引起的牙齿疾病的抗体。在癌症治疗中使用的抗体，用传统技术生产远远供不应求，如果用转基因植物进行生产，将有可能大量提供所需抗体，并且价格低廉。

　　作为生物反应器，科学工作者也在探索利用转基因植物生产其它产品，如生物降解塑料、工业用润滑剂和洗涤剂等大量化工产品。Calgene公司已经用转基因油菜生产工业用润滑剂和12-碳的脂肪酸来生产洗涤剂。由于油菜很容易栽培并生成大量优良油脂，Calgene公司进一步获得了生产芥子酸的转基因油菜，用来生产润滑剂和尼龙13-13，基因来自于希蒙得木（Simmondsia chinensis）和Meadowfoam。

　　美国斯坦福大学Somerville的研究小组将微生物的可以生产生物降解塑料多羟基丁酸（PHB）的基因转入拟南芥菜，经过改造的基因提高了该基因表达水平100倍，转基因的拟南芥菜植株生长和种子产量正常。Agracetus公司的研究人员也在进行类似的研究，他们将与PHB有关的基因转入棉花，以生产生物降解塑料。这些公司的研究成果，将取代目前用石油作原料生产化工产品，为解决越来越少的石油资源，找到解决途径。

　　随着转基因植物作为生物反应器的研究的深入发展，将来的农场，不只是生产粮食、棉花等的传统农业，也会涌现一批化学农场、疫苗农场、塑料农场等等，将为今后农业、工业及其它产业如制药业等带来一场重大的变革。