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第十讲：基因治疗与基因工程药物 第三节 基因工程药物
基因工程一般是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。基因工程的主要特征是可以把来自任何一种生物的基因放置在与其毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞中，从而，有可能按照人们的主观愿望，创造出自然界原先并不存在的新的生物类型。基因工程从诞生到现在才不过２０多年的历史，在这期间所使用的名词有遗传工程（genetic engineering）、基因工程（gene engineering）、基因操作（gene manipulation）、重组ＤＮＡ技术（recombinant DNA technique）、基因克隆（gene cloning）和分子克隆（molecular cloning）等，这些名词术语的差别，只不过是各自考虑的角度和侧重点不同而已。 基因工程药物是指利用基因工程技术生产人体健康所必需的、起着重要调节作用的、含量极微和难以用传统方法制取的蛋白质、多肽、疫苗、单克隆抗体及细胞因子等药物。这一类药物实质上多是人体内的成分，它们调节人体的各种生理功能，维持细胞的生长和发育，提高机体的免疫力。这些成分的缺乏将导致一系列疾病，如癌症、心脑血管病、神经性疾病、糖尿病及遗传病等。由于在正常情况下这些成分含量极低，无法直接提取，只能利用基因工程技术将将这些药物的基因导入微生物细胞，使微生物按照人们的意愿生产这类药物，经过大规模发酵、纯化、包装、检验等工艺制成基因工程药物。 细胞因子是由人类或动物机体的各类细胞合成和分泌的小分子多肽类因子，它们调节多种细胞的生理功能和免疫应答，在异常情况下也会导致病理反应，这些因子统称为细胞因子（cytokines），包括干扰素（interferon，IFN）、白细胞介素（interleukin，IL）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，THF）和各种生长因子等。细胞因子的种类很多，生物学活性广泛，但许多细胞因子在合成、分泌、理化性质和生物学活性以及参与免疫和炎症反应的特性上有许多共性。表现在：（１）多源性，指细胞因子来源的多样性，几乎没有一种细胞因子只是由单一类型的细胞产生，即一种细胞因子可以源于多种细胞，而且同种细胞也可以产生多种细胞因子。（２）多效性，细胞因子在调节多种细胞发挥其特异性功能方面起着重要作用，而且一种细胞因子常常可以调节多种细胞发挥其生物学活性。（３）高效性，细胞因子的生物学效应具有微量和高效的特点，其有效浓度一般在10-10-10-14mol/L之间，如此微量的物质就能引起非常明显的生物学效应，足以证明其作用的高效性。（４）快速反应性，对机体产生的激发因素迅速作出反应。（５）细胞因子是一类大分子多肽或蛋白质分子，而且绝大部分为糖蛋白，但糖基成分对大部分细胞因子的生物学活性影响不大。细胞因子的分子量均小于80kD，多数为20-30kD。 细胞因子的作用方式与内分泌激素相似，其分泌效应一般可分为两种。第一，旁分泌效应，当细胞受到刺激后，其合成的细胞因子分泌到细胞的外周，作用于相邻的且具有该细胞因子相应受体的靶细胞，启动其应答功能并发挥细胞因子的效应。第二，自分泌效应，细胞在合成和分泌细胞因子的同时，自身细胞也表达相应的受体，并与其分泌的细胞因子相结合，引起更强的生物学效应。细胞因子通过作用于特定靶细胞上的特定受体，将信息传递至细胞核，调节多种基因表达的增强或抑制，导致细胞启动或关闭特定蛋白质的合成，使细胞功能发生变化，具体表现在促进细胞的增殖或使细胞的生长受到抑制。 干扰素（interferon，IFN）是由细胞分泌的一类在同种细胞上具有广谱抗病毒，抗细胞分裂，免疫调节等多种生物学活性的蛋白质，它通过激活细胞基因而合成多种相应的蛋白质，发挥其多样化的生物学功能。干扰素是一类细胞功能的调节物质，即是一种细胞因子。干扰素本身并不能直接灭活病毒，干扰素作用于细胞后，使后者又产生多种其它抗病毒蛋白质，进而阻断病毒的繁殖。干扰素分为两种类型，第一种类型包括IFNα和 IFNβ，分别主要由白细胞和成纤维细胞产生，而且同一细胞常常可以产生多种干扰素；第二种类型包括IFNγ，主要由T细胞产生。某些刺激因素如病毒、微生物、抗原和其它细胞因子等均可以刺激或抑制干扰素的产生。两种类型的干扰素除具有抗病毒作用和抑制细胞生长作用外，还具有免疫调节作用如激活杀伤细胞、单核巨噬细胞系统，加强淋巴细胞毒作用等。所以说，干扰素是一组多功能的细胞因子，是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物。 基因工程干扰素的制备主要包括干扰素基因的克隆、表达和纯化三个主要阶段。首先用诱生剂诱导细胞后，提取干扰素的mRNA，并反转录成cDNA，然后再与质粒DNA重组，转化受体菌株，通过重组DNA的复制，干扰素基因的转录、翻译，使干扰素得到表达，最后通过多步纯化步骤，制备出干扰素产品。自1979年Taniguchi用基因工程法获得人成纤维细胞干扰素基因的克隆，1980年Nagata等通过重组DNA技术制备出重组干扰素α-2亚型（IFNα-2）以来，迄今国内外已从人基因组中相继成功地克隆了近20余个干扰素成员的基因，并分别获得表达成功。1989年9月人基因工程干扰素α-1经卫生部新药审评委员会审评通过。成为我国第一个被国家正式批准生产的基因工程药物。目前，干扰素在乙型肝炎、丙型肝炎、毛细胞白血病、慢性白血病、类风湿性关节炎等方面效果明显，现已经成为这些疾病的首选药物。 白细胞介素（interleukin，IL）是指由白细胞或其它体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的一类细胞因子。由单核－巨噬细胞、纤维母细胞、骨髓基质细胞和T细胞等多种细胞产生。自1979年瑞士国际淋巴因子研讨会为白细胞介素命名以来，从白细胞介素－1开始，迄今已命名到白细胞介素－18，而且随着研究的逐步深入，预计还将有更多的白细胞介素被发现。目前的研究表明，许多白细胞介素不仅介导白细胞间的相互作用，还参与其它细胞间的相互作用，如造血干细胞、血管内皮细胞、神经细胞和纤维母细胞等。各种白细胞介素的生物学功能如下表。
上述所有白细胞介素的基因均已获得克隆和表达，并且多半已制成基因工程白细胞介素的纯品，有的已经投放市场，当然大部分仍处在临床研究阶段。这些白细胞介素的发现，为肿瘤治疗和其它疾病的治疗开辟了新途径，特别是白细胞介素－２的问世，给细胞免疫基础理论的研究或肿瘤的生物治疗提供了物质基础。 白细胞介素－２是第一个被批准上市的基因工程白细胞介素类药物。白细胞介素－２是机体免疫调节网络的核心物质，是激活免疫效应细胞和产生协同作用的效应因子，共同完成机体免疫机能的平衡调节作用，能共同有效地清除肿瘤细胞和病毒或细菌感染的细胞，起到致病防病的作用。具体作用表现在： （1）抗病毒感染 白细胞介素－２能激活淋巴因子激活杀伤细胞（Lymphokine activated killer cells，LAK细胞），清除被病毒感染的肝细胞，并诱导产生干扰素-γ和肿瘤坏死因子，使得病毒对健康肝细胞的再次感染受到抑制，因而白细胞介素－２可以用于治疗病毒性肝炎。 （2）抗细菌感染 白细胞介素－２能提高机体清除细菌的能力，有效地清除被细菌感染的细胞，因而可以用于治疗分枝杆菌和真菌的胞内感染。 （３）抗肿瘤治疗 在恶性肿瘤的发病机制中，非常关键的问题是机体的免疫功能失调和免疫监视功能降低。免疫监视功能的降低具体表现在肿瘤病人体内的NK、CTL、LAK等杀伤细胞功能降低，从而不能正常有效地清除肿瘤细胞。白细胞介素－２能诱导和促进肿瘤病人体内的NK、CTL、LAK等杀伤细胞的活化和增殖，提高病人的免疫功能和免疫监视功能，有效地清除肿瘤细胞。目前认为白细胞介素－２对肾细胞癌、黑色素瘤疗效明显，其次是肺癌、直肠癌和乳腺癌等，对白血病也有一定疗效。 （４）免疫佐剂作用 白细胞介素－２可以作为疫苗的免疫佐剂，对接种乙肝疫苗无抗体产生的幼儿，如果先接种一定量的白细胞介素－２后，再接种乙肝疫苗，则幼儿体内很快就会出现抗乙肝表面抗原抗体。 集落刺激因子（colony-stimulating factor, CSF）是一类控制粒细胞，单核－巨噬细胞和某些有关的造血细胞的繁殖和分化的糖蛋白分子。又称为造血刺激因子或造血调节因子。主要包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和多能集落刺激因子(Multi-CSF)四类。各种集落刺激因子在刺激造血细胞的增殖、维系祖细胞存活和延长成熟细胞寿命方面具有重要作用，此外，集落刺激因子还能在影响细胞毒作用、膜抗原的表达、过氧化物的产生、杀伤微生物及肿瘤细胞，以及刺激机体产生许多重要的生理活性物质，如γ干扰素、白细胞介素－ （１）肿瘤坏死因子等方面发挥重要的功能。 G-CSF主要来源于巨噬细胞、内皮细胞和纤维母细胞。既能高度特异性地刺激中性白细胞系前体细胞的存活、增殖和分化，又是成熟的中性白细胞的功能活化因子。在维持体内中性白细胞水平和活性上起重要作用。 GM-CSF主要来源于Ｔ细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和纤维母细胞。既能刺激骨髓祖细胞增殖、分化形成粒细胞和巨噬细胞集落，还能刺激嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的前体细胞及早幼红细胞和多能祖细胞的初期增殖。同时GM-CSF还可以促进成熟造血细胞的产生，增强成熟细胞对细菌和寄生虫感染的反应能力。 M-CSF主要来源于巨噬细胞、纤维母细胞、单核细胞。能增强巨噬细胞的细胞毒性，是集落刺激因子中唯一没有种间特异性的集落刺激因子。 Multi-CSF来源于活化的Ｔ细胞。它作用于更为原始的靶细胞，如作用于一些具有自我更新能力的多能造血干细胞和祖细胞，产生嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨核细胞。 上述４种集落刺激因子注入人体后均有促进各类白细胞增殖和成熟、增加血小板和红细胞数量的作用，因此临床上多用做癌症化疗的辅助药物，用于治疗因化疗所引起的中性粒细胞减少症。还用于治疗白血病、粒细胞缺乏症、骨髓发育不良综合症、再生障碍贫血和血小板缺乏症。 癌症患者化疗或放疗后，由于化疗药物和放射线的副作用，常常会出现以白细胞为主的全血细胞减少症，致使病人无法继续进行化疗或放疗，最终死于感染和出血等。G-CSF 和GM-CSF两种集落刺激因子均能够刺激骨髓干细胞的分化和增殖，使足量祖细胞进入外周血液，减轻甚至预防癌症治疗中的骨髓抑制作用，提高抗癌药物用于人体的允许剂量，保证患者能正常进行化疗或放疗，并促进化疗后免疫力的恢复，减少感染发生率和近期死亡率。 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，不仅对肿瘤细胞具有细胞毒杀伤作用，而且还参与抗病毒、抗感染、凝血、发热和休克等多种病理生理过程。TNF主要由激活的巨噬细胞和淋巴细胞产生。由活化的巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子称为TNF-α，这种因子可以使带瘤动物的肿瘤发生出血性坏死，并且该因子的细胞毒作用只选择作用于肿瘤细胞，对正常的细胞无毒性。由活化的淋巴细胞产生的称为TNF-β。由NK细胞产生的细胞毒性因子称为TNF-γ。TNF基因的克隆和表达均已取得成功，目前已经制备出大量重组基因工程肿瘤坏死因子，并用于临床及理论研究。 肿瘤坏死因子生物学活性的发挥，离不开存在于靶细胞表面的肿瘤坏死因子的受体（TNFR）。不同细胞TNFR的数目和亲和力有很大差异，而且细胞表面的受体数目与该细胞对TNF的敏感程度不是正比关系。TNF与细胞表面相对应的受体结合后，其信号传递的机理还不清楚。 肿瘤坏死因子的生物学活性主要表现在以下几个方面： （１）抗肿瘤活性 TNF对肿瘤细胞具有直接的抑制其增殖的作用和细胞坏死作用，但不影响正常细胞的生长、分化和代谢功能，甚至对有的细胞还具有促进作用。TNF与肿瘤细胞表面的特异性受体结合后被溶酶体摄入，在溶酶体内对溶酶体膜产生作用，致使膜通透性增加，使溶酶体内的蛋白酶释放到细胞质中，最终导致细胞溶解。另外，TNF在体内也可以发挥抗肿瘤效应，引起肿瘤坏死，肿瘤体积缩小，甚至消退。TNF的抗肿瘤作用及其机制可能与以下几个方面有关：（1）对肿瘤细胞有直接的细胞毒作用及细胞生长抑制作用；（2）肿瘤内血管阻撒阻塞致使肿瘤发生缺血性坏死；（3）与机体的免疫机能有关。由于TNF具有选择性杀伤肿瘤细胞的功能，因此TNF在肿瘤的治疗中将起着十分重要的作用。 （2）炎症性介质作用 许多外来刺激物，如内毒素、病毒、原虫等均可引起体内TNF的释放，而TNF的分泌又可以引起其它因子如IL-1、CSF等的释放，这些细胞因子在机体炎症的启动、维持和消退等方面都起着重要作用。因此可以认为TNF是炎症反应的重要介质，在介导宿主细胞的炎症反应及组织损伤等过程中发挥着重要作用。 （３）对血脂的影响 TNF能抑制体内脂肪细胞合成脂蛋白脂酶（LPL），使体内脂肪细胞合成的LPL减少，导致甘油三酯释放增加，造成高甘油三酯血症。由于由于脂质长期存积于血液中，使患者食欲不振、体重减轻、肌肉萎缩，导致恶病质状态。 （４）抗病毒作用 TNF的抗病毒作用对象包括DNA病毒和RNA病毒，对爱滋病病毒（HIV），TNF和IFN具有协同抑制作用，可使正常细胞对HIV的感染产生抵抗作用，杀死HIV感染的细胞。TNF的抗病毒作用主要是通过抑制病毒的复制、抑制病毒介导的细胞病变发展、诱导未感染的细胞产生抗病毒能力、选择性杀伤被病毒感染的细胞等途径来实现的。 此外，TNF在抗细菌和抗真菌、促进细胞因子的分泌、增强机体的抵抗力及促进骨质吸收等方面也发挥着重要作用。 人生长激素（human growth hormone，hGH）是脑下垂体前叶分泌的蛋白质类激素，对人体除神经组织以外的所有组织（包括骨骼、肌肉、结缔组织、毛发和皮肤等）都有促进生长的功能。还能促进脂肪和糖类的降解，增强蛋白质和核酸的合成作用。这些生理功能不是人生长激素直接作用于细胞的结果，而是通过被生长激素作用的细胞释放各种生长因子来发挥其生物学作用，如释放类胰岛素生长因子Ⅰ等。近年来的研究发现，生长激素在治疗侏儒症、烧伤、肥胖、出血性溃疡及在维持肌肉的活力、改善心脏功能、延缓衰老、防治骨质疏松、促进伤口愈合等方面均具有重要的作用。此外，对免疫系统也具有一定的增强作用。 过去在临床上使用的生长激素主要来源于人的脑垂体，远不能满足临床的需要。1979年，人类首次利用基因工程技术在大肠杆菌中表达了人的生长激素，1985年美国FDA首先批准了重组人生长激素上市。我国从1986年开始应用进口基因重组人生长激素对儿童生长激素缺乏的患者进行治疗。目前已经有瑞典Genotropin、瑞士Saizen、丹麦Norditopin和美国Humatrope四家药厂的重组人生长激素在我国注册用以治疗儿童生长激素缺乏症。国内数家生产基因重组人生长激素的药厂已经或将经卫生部批准试生产该药物，这必将促进人生长激素在治疗生长激素缺乏症和改善人体其它功能方面的应用，进一步提高人民的体质和生活质量。 血栓性疾病，特别是心脑血管血栓性疾病已经对人类的生命和健康构成了严重的威胁。循环血液中的异常物质随血流移动，堵塞血管的现象，称为血栓塞。如肺动脉、脑动脉等的栓塞。栓塞对机体的影响取决于栓塞的部位、血管的解剖特点和局部血液循环状态、栓塞后能否建立充分的侧枝循环等。有的栓塞不引起症状，有的可引起组织坏死，有的（如巨大肺动脉栓塞、脑动脉栓塞等）则可招致病人猝死。血栓栓塞是指血栓全部或部分脱落引起的栓塞，又分静脉血栓栓塞及动脉系统栓塞。静脉血栓全部或部分脱落，随血流流向右心，并从右心进入肺动脉。巨大的栓子阻塞于主要的肺动脉，常引起病人猝死。若体积小的栓子阻塞于无明显病变的肺中，由于肺部有肺动脉及支气管动脉双重血液供应,常不引起明显病变。在卵圆孔未闭的病人，栓子可从右心房进入左心，可能引起动脉栓塞（如肾动脉、脑动脉的栓塞等）。这种现象称反常性栓塞或奇异性栓塞。动脉性栓子常栓塞于脑、肾、脾等的动脉。可引起组织坏死。 影响血栓形成的因素主要有三方面： （1）血管内皮细胞损伤。 正常血管的内皮细胞能防止血小板、凝血因子与血管内壁成分发生反应，抵抗血栓的形成。当血管内皮细胞受损后，内皮暴露出的胶原可促使血小板的粘附、释放和聚集，并激活凝血因子而触发凝血，最终形成血栓。 （2）血液成分改变，包括血小板活化、凝血因子激活、纤维蛋白形成等。 （3）血液流速降低或停滞，血流缓慢使血液粘度增高，而粘度增高反过来又引起血流缓慢。静脉血栓的形成与血流缓慢有直接关系。 血液的凝固性、纤溶活性与血栓的形成有密切的关系。血纤维蛋白原在血浆中的溶解度很大，但它被称为凝血酶的蛋白水解酶作用后转化为血纤维蛋白单体，这种单体在血浆中的溶解度很低，而且血纤维蛋白单体能自发地缔合形成血纤维，后者在血浆中的溶解度更低。在血浆蛋白溶解过程中，无活性的纤维蛋白酶原（纤溶酶原）在纤溶酶原激活剂的作用下转变为有活性的纤维蛋白溶酶（纤溶酶）。纤溶酶能水解纤维蛋白、纤维蛋白原和其它凝血因子。在正常生理条件下，血液凝固系统与纤维蛋白溶解系统保持着动态平衡，维持机体的健康。 溶血栓药物主要是通过利用纤溶酶原活化物激活纤维蛋白酶原形成纤溶酶，继而溶解纤维蛋白，成为可溶性的纤维蛋白降解产物，达到溶栓的目的。目前溶血栓类药物主要有： （１）尿激酶：从人尿或人肾上皮细胞培养液中提取，能直接激活纤溶酶原，由于尿激酶不能与纤维蛋白结合，因此主要作用于液相中纤溶酶原的活化，目前广泛用于急性心机梗塞、脑血栓、肺梗塞等疾病的治疗。 （２）链激酶：是从β溶血性链球菌菌株培养液中分离、纯化得到的一种蛋白质药物。是临床上使用最早的溶栓剂。它通过间接活化纤溶酶原，转化为纤溶酶，产生溶栓作用，也能降解纤维蛋白原和某些凝血因子。链激酶对血栓中纤维蛋白的亲和力低，易产生出血等副作用，目前美国心脏、神经学会的医疗顾问委员会以停止推荐链激酶作为急性脑梗塞的治疗。 （３）组织型纤溶酶原激活物：是一种存在于血管内皮及其它器官的丝氨酸蛋白酶，是第一个基因工程溶血栓药物。对血栓中纤维蛋白具有高度亲和力，能特异性地作用于血块表面并与之形成一种组织型纤溶酶原激活物－纤维蛋白复合物，直接催化纤溶酶原转化为纤溶酶而溶解血栓，溶栓作用强，效果好，无过敏反应。 （４）葡激酶：是金黄色葡萄球菌产生的一种蛋白质，是又一种基因工程溶栓药物。能特异性地与纤维蛋白结合，具有快速高效的纤溶酶原激活作用。
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