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第十讲：基因治疗与基因工程药物 第一节 基因治疗
从分子生物学角度来看，基因治疗（gene therapy）可以理解为用正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法。从广义疾病治疗的角度讲，可以认为凡是将新的遗传物质转移到某一个体的细胞内，使功能正常的基因或表达量很低及原来不存在的外源基因得到正常表达，赋予患者新的抗病功能，从而达到治疗目的。由表达产物发挥治疗作用的基因治疗方法称为基因疗法（gene therapeutics）。它是一项高度集成、综合性和高难度的生物高技术。它集中了基因的分离、基因向人体的导入和基因在人体内的高效表达及其调控等多方面的技术。由于基因治疗的对象是人体，因此基因治疗既要求有效又要确保安全，它的难度远高于基因在体外（如细菌、酵母或哺乳动物细胞）表达的基因工程技术。 基因治疗的首次实际应用始于1990年9月，Blaese等对美国一名患腺苷脱氨酶（ADA）基因缺陷病的4岁女孩进行了人类历史上首次基因治疗获得成功，它标志着基因治疗临床应用阶段的开始。一年之后，又在一名9岁的儿童身上进行了临床试验。均取得了较好的治疗效果。腺苷脱氨酶基因缺陷病是一种罕见的遗传性免疫缺陷疾病，这种病是由于缺少腺苷脱氨酶而引起的。ADA 缺乏者有反复受感染的危险，并且极容易较早患上癌症，其中许多人在出生后的头几个月里就会死去。ADA缺乏症的根源在于身体因遗传信息的缺损而丧失了制造某种化学物质的能力。这种病只出现在那些从双亲那儿遗传了有缺陷的ADA基因的儿童身上。如果一名儿童从双亲的其中一方遗传了有缺陷的基因，而从另一方遗传了正常的基因，则这名儿童就不会患有这种疾病，但有可能把这个有缺陷的基因遗传给下一代。 近年来，基因治疗的研究取得了重大进展，研究内容也已经从单基因的遗传病扩大到多基因的肿瘤、爱滋病、心血管病和神经系统疾病等方面。可以预见，基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段，将在一定程度上改变人类疾病治疗的历史进程。 基因治疗的成功与否在一定程度上取决于人们对人类基因组结构与功能的了解和对引发疾病分子机制的认识。基因治疗的策略取决于疾病的种类。概括起来主要有以下几种： （1）基因置换，用正常的外源基因替换产生疾病的基因，使致病基因得到永久地更正。如果能够将缺陷基因在原位替换，并保证患者基因组序列不发生其它改变，且可以接受体内原有的调控系统，维持原有的表达模式，这就是最理想的基因治疗方法。 （2）基因修正，将致病基因的突变碱基序列加以纠正，而基因的其它正常部分予以保留。因为单基因遗传病在多数情况下是由于基因内部的单个碱基发生突变而引起的，其它核苷酸序列均是正常的，因此只要将突变的单个碱基予以更正就能达到基因治疗的目的，而不必将整个基因进行置换。 （3）基因修饰，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可以补偿致病基因的功能，致病基因本身并未得到改变。由于已经发展了许多有效的方法可以将目的基因导入真核细胞，并获得表达，因而是目前较为成熟的方法。只是由于目的基因不是在原位导入的，所以治疗效果有时并不理想。 （4）基因抑制，导入外源基因去干扰、抑制有害基因的表达，如向肿瘤细胞导入肿瘤抑制基因，以抑制癌基因的表达。 （5）基因封闭，利用反义技术封闭某些特定基因的表达，以达到抑制有害基因表达的目的。反义技术是以mRNA为靶分子，用特定的可与靶分子互补的DNA或RNA分子与mRNA形成双链，从而改变RNA 的剪接方式、阻断翻译甚至摧毁异常RNA，在剪接或翻译水平上调节基因的表达。 基因转移技术是基因治疗的关键技术之一。基因转移的途径有两类，一类是in vivo（体内），即活体直接转移，是将带有遗传物质的病毒、脂质体或裸露的DNA直接注射到试验个体内；另一类是ex vivo（离体），称为回体转移，是将试验对象的细胞取出，在体外培养并到入基因后，将这些经过遗传修饰的细胞重新输回到试验个体体内。ex vivo方法比较经典、安全、效果容易控制，但缺点是步骤多，技术复杂，难度大，不容易推广；in vivo方法操作简便，容易推广，缺点是方法尚未成熟，存在疗效短、免疫排斥和安全性等问题，但它是基因转移的方向，只有in vivo基因转移方法成熟了，基因治疗才能真正走向临床。 基因转移的方法可以分为物理方法、化学方法和生物学方法三大类。 （1）物理方法 包括裸露DNA的直接注射，DNA颗粒轰击，电脉冲介导法，显微注射法等。如Agracetus公司开发出一种粒子加速装置，它可以使携带有外源DNA的金颗粒打入到机体的一定部位以产生治疗作用。 （2）化学方法 包括DNA磷酸钙共沉淀法、脂质体包埋法、DEAE-葡聚糖法和多聚季胺盐法等。其中以脂质体介导的基因转移方法应用较多。 物理方法和化学方法属于非病毒的方法，它们可以转移仅仅由DNA组成的载体，并以来不同的机制将大分子物质直接摄入哺乳动物细胞中，并在细胞内运输。由这些方法转移的外源基因的表达是暂时的，因为这些基因不容易整合到宿主细胞的基因组中，容易被细胞内的DNA酶降解，并将其排出体外。但是这些方法不存在野生型病毒的污染问题，也不会诱导免疫反应，理论上比病毒介导的基因转移方法安全。 （3）生物学方法 主要指病毒介导的基因转移，包括RNA病毒和DNA病毒两类。如逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺病毒相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、禽类病毒(PoV)、痘苗病毒(VV)和细小病毒(PaV)等。病毒作为基因转移的载体，各有其优缺点。逆转录病毒载体能将外源基因稳定地插入靶细胞的染色体中，进行复制和转录，因此转基因效果比较稳定、表达持续时间较长。另外，逆转录病毒可感染的细胞范围广、感染效率较高；腺病毒载体有较大的宿主范围，可以感染非分裂期细胞，且由于其感染细胞时不整合到宿主染色体，潜在的致癌危险性小；腺病毒相关病毒则因能将外源基因定点整合至宿主细胞，因而具有较逆转录病毒更优越的特性；单纯疱疹病毒具有嗜神经性，可用作中枢神经系统靶向的良好载体，不整合入宿主基因组，但可以在细胞内长期存在，有可能获得稳定的表达，且不会引起被感染细胞出现插入突变的可能性。由于逆转录病毒载体可能产生具有复制能力的逆转录病毒，而且由于逆转录病毒载体在染色体上的随机整合，有可能造成插入突变、干扰和影响细胞中某些正常基因的复制和转录，甚至激活一些癌基因的表达，产生严重的后果，因而在安全性方面具有潜在的危险。腺病毒和痘苗病毒载体由于表达时间有限，所以很难用于需要长期稳定表达的一些基因治疗项目，如遗传病的基因治疗等。 基因治疗的步骤是：①必须分离出具有特定功能的特异性基因；②必须能够获得足够数量的携带有该基因的载体和细胞；③必须建立一条有效的途径将该外源基因导入体内、转染靶细胞；④转染并进入宿主细胞的目的基因必须能产生足够量的产物，可以维持适当长的时间，且不产生有害的副作用。 （1）选择目的基因的原则 ①待研究基因的异常是疾病发生的根源；②该基因遗传的分子机制已经研究清楚；③基因已经被克隆，且表达调控机制较为清楚；④转移的基因在受体细胞内最好能够完整地、稳定地整合到宿主细胞的染色体中，并能时世适量表达功能性蛋白质。基因治疗中选择的目的基因可以来自染色体的基因组，也可以来自来源于mRNA的互补DNA（cDNA），而且以后者居多。另外，目的基因必须置于合适的启动子控制之下，且必须含有完整的信号肽，只有这样，目的基因才可能获得适当的表达。 （2）选择受体细胞的原则 ①最好选择组织特异性细胞，以便使外源基因只在该特异性组织细胞中表达，而在其它组织中不表达或表达水平很低；②细胞要易于从体内取出，有增殖趋势，且生命周期较长；③离体的细胞应能接受外源基因转染；④细胞经过体外基因操作后能够存活下来，并能安全输送回体内。遗传病的基因治疗研究较多的靶细胞是造血干细胞，皮肤成纤维细胞，成肌细胞和肝细胞；而肿瘤的基因治疗多采用肿瘤细胞本身，其次是淋巴细胞和造血干细胞。 （3）基因载体的选择 基因载体的作用主要有两个方面，第一，基因载体中含有调节控制基因复制、表达的调控元件，使目的基因在宿主细胞内能够得到适量表达；第二，基因载体作为一种携带目的基因的工具，便于导入宿主细胞。基因载体主要有质粒载体和病毒载体两类。质粒载体一般采用物理方法或化学方法导入靶细胞；含有外源基因的病毒载体在基因治疗中首先是将重组载体以不同方式进行包装，获得重组的病毒颗粒，再感染靶细胞。 遗传病是指由人体内的遗传物质发生改变所引起的疾病。根据遗传物质的变异情况，遗传病可以分为三类： （1）单基因遗传病 指由单个基因发生突变所引起的疾病。突变可以只发生在一对同源染色体的一条染色体上，也可以发生在一对同源染色体的两条染色体上。单基因遗传病主要包括分子病和遗传代谢病。分子病是指由于人体内遗传物质的缺陷导致蛋白质分子的结构和数量的异常所引起的疾病。如血红蛋白病等。遗传代谢病是指因酶的先天性缺陷而产生的疾病，如氨基酸、糖类及脂类代谢异常等。 （2）多基因遗传病 指由多个基因与环境因子共同作用所引起的遗传性疾病。多基因遗传病既受遗传因素的影响，又与环境因素有密切的关系。如常见的高血压病，冠心病，精神分裂症等。 （3）染色体异常病 遗传物质的突变涉及到染色体上的很大一部分，如染色体部分断裂后出现的染色体易位、缺失、倒位和重复等染色体畸变，均导致遗传物质偏离正常状态，引起疾病。 （１）血红蛋白病 血红蛋白由珠蛋白和血红素辅基组成。每个血红蛋白分子是由４个亚单位构成的四聚体，每个亚单位由一条珠蛋白肽链和１个血红素辅基构成。血红蛋白病属于单基因遗传病，其中比较常见的镰刀型贫血症和β地中海贫血症都是由于β珠蛋白基因的突变或缺陷所致。地中海贫血是指由于珠蛋白链合成速率降低，导致一部分珠蛋白链合成过多，一部分珠蛋白链合成过少甚至缺失造成的。因此，对这类疾病的基因治疗就是要解决珠蛋白表达比例失调的问题。由于β珠蛋白基因的表达有很强的组织特异性，其需要量又很大，且需要精确的调控，这给该病基因治疗的研究带来很大的困难。 研究证实，在血红蛋白病中，镰刀型贫血和β地中海贫血都是由于成人β珠蛋白活性水平很低所致，而β珠蛋白的活性降低又与机体中γ链基因完全关闭有关，因此如果采用让γ链基因持续开放或者使已经关闭的γ链基因重新激活，就有可能解决珠蛋白表达比例失调的问题，进而在基因水平上治疗上述两种贫血病。 （２）血友病 血友病是一种常见的遗传性出血性疾病，它是由于血液中缺乏某种凝血因子而导致患者的凝血功能出现障碍。根据患者所缺乏的凝血因子的种类不同，可以将常见的血友病分为血友病A、血友病B和血友病C三类。其中血友病A缺乏凝血因子Ⅷ，血友病B缺乏凝血因子Ⅸ，血友病C缺乏凝血因子Ⅺ。血友病的共同特点是机体在受到轻微损伤时，就回出现出血不止的倾向。传统的治疗方法是患者输入新鲜的血液或注射含有上述凝血因子的血制品替代治疗，但由于近年来血源污染严重，使患者容易感染肝炎病毒或爱滋病病毒，引起输血相关并发症。因此，人们一直在寻找一种可以替代传统方法的治疗血友病的新方法。基因治疗是将正常基因转入患者体内替代缺陷基因，从基因水平上纠正基因的缺陷，从而达到治疗的目的，为血友病的治疗开辟了一条新途径。 复旦大学遗传学研究所薛京伦教授领导的研究小组，经过多年的努力，已使血友病B成为世界上少数几种进入基因治疗临床试验的病种之一。从1987 年起，复旦大学遗传所就以血友病B为基因治疗的研究对象。他们用携带有人凝血因子Ⅸ cDNA的逆转录病毒载体感染患者自身的皮肤成纤维细胞，感染的细胞经培养、筛选和培养上清凝血因子Ⅸ的测定，以及细胞连续传代形态学观察、染色体分析、内毒素过敏试验、裸鼠接种试验、常规病理学检查和辅助病毒的PCR检测等多项试验证实，均未发现致畸和致癌现象。在此基础上于1991年11月对2例血友病B患者进行了世界上首次血友病B基因治疗的临床Ⅰ期试验，这两名患者从小就有自发性或轻微外伤后出血不止的现象，主要表现为关节出血、肌肉出血和鼻出血。目前，共有4名血友病B患者接受了基因治疗。患者经治疗后体内凝血因子Ⅸ浓度上升，出血症状不同程度减轻，2位患者疗效较显著，其中1位治疗后年内没有出现自发出血现象。4位治疗后均未出现与基因治疗有关的毒副反应。血友病B的临床基因治疗才刚刚起步，凝血因子Ⅸ的水平只能达到正常值的5%，只能使血友病患者从中型转变为轻型，还不能从根本上使血友病患者消除症状，因此，选择更好的表达载体和靶细胞以便获得凝血因子Ⅸ在体内的长期高效表达，以及建立更为简便有效的基因转移和细胞移植途径等问题都还有待于进一步研究。 （３）家族性高胆固醇血症 家族性高胆固醇血症是由于低密度脂蛋白受体缺陷而导致血中胆固醇水平过高，患者多死于冠心病。是一种多基因遗传病。通过基因治疗可以表达更多的低密度脂蛋白受体，以便降低血液中胆固醇的水平。 1992年6月Ｗillson等利用低密度脂蛋白受体cDNA构建的逆转录病毒载体，感染体外培养的肝细胞，并将受感染的肝细胞输回体内，经治疗后，患者血清中的胆固醇下降20%-40%，取得了明显的治疗效果，被誉为英雄的基因手术。上述受感染的肝细胞输回体内后，转染的基因可能只是有效地纠正了肝脏某处的3%-4%的肝细胞，如果能纠正5%的肝细胞，就可以使患者的症状得到明显改善；如果能使被纠正的肝细胞超过15%，患者就能正常生活。为克服上述基因治疗的缺点，用腺病毒代替逆转录病毒可能更有效。有关这方面的研究正在进行动物实验。 肿瘤基因治疗（gene therapy of cancer）是指以适当的基因转移技术将特定的外源基因导入肿瘤细胞或患者体细胞内，通过外源基因的表达产物或其对宿主细胞本身基因表达的影响，直接或间接地杀伤或抑制肿瘤细胞，或为其它肿瘤治疗方法创造有利条件的一种肿瘤生物治疗方法。从基因的角度来看，肿瘤是一种体细胞遗传性疾病，肿瘤发生的关键环节是遗传物质DNA分子的改变，肿瘤只是一种外在的表型。从正常体细胞发展成为肿瘤细胞要经过许多过程，涉及细胞多种遗传性状的改变，在肿瘤发生的每一步都可能涉及基因结构的改变或基因功能的改变或基因产物性质的改变。尽管基因治疗的研究和应用起源于对遗传病的治疗，但近年来肿瘤基因治疗的发展却远远超过了遗传病的基因治疗，这主要是由于（1）恶性肿瘤的发病率远远高于遗传病的发病率，患恶性肿瘤病的人数远多于遗传病的患者；（2）外源目的基因的选择不局限于有缺陷的或病变的基因，只要能达到治疗肿瘤目的的而对正常体细胞无害的基因均可以采用，外源目的基因选择的余地增大；（3）肿瘤的基因治疗不需要象遗传病那样终生持续应用，而只需要较短的疗程即可；（4）肿瘤的基因治疗不需要外源基因持续表达，阶段性表达甚至一过性表达也可以达到杀伤肿瘤细胞的目的；（5）多数肿瘤基因治疗是将目的基因导入肿瘤细胞，因此对目的基因表达调控的要求远不如遗传病治疗时严格。目前，有关肿瘤基因治疗的研究主要集中在以下几个方面： 细胞因子是免疫活性细胞分泌的多肽类物质，它们调节多种细胞的生理功能和免疫应答。将编码细胞因子的基因导入细胞，使其在宿主或局部肿瘤中稳定、持续的表达，通过增强肿瘤微环境中抗癌免疫达到治疗肿瘤的目的。常用的细胞因子白细胞介素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ，干扰素－α，肿瘤坏死因子（TNF）和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。 在肿瘤的发生和演变的过程中，涉及多个肿瘤的抑制基因和癌基因的改变。其中，肿瘤抑制基因的失活与肿瘤的发生密切相关。将正常的肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞可以替代或补偿有缺陷的基因，从而达到抑制肿瘤的生长或逆转其表型的目的。如p53基因就是人类肿瘤发生过程中最常发生变化的肿瘤抑制基因之一。 自杀基因所编码的蛋白产物能够使无毒性的化疗药物的前体在细胞内转换为强毒性药物，导致肿瘤细胞“自杀”而死亡，达到选择性地杀伤肿瘤的目的。正常组织由于未转染该基因，不能表达该“自杀基因”的产物，因而不能激活前体药物，避免了组织的损伤。 在肿瘤的治疗中，化疗药物对骨髓具有抑制作用。如果将多药抗药基因导入骨髓细胞，就能使包括化疗药物在内的多种胞内物质排除至细胞外，使细胞获得抗药表型，保护机体造血组织免受化疗药物细胞毒作用，从而提高机体对化疗药物的耐受剂量，可以通过加大化疗药物的应用剂量，来增强药物对肿瘤的疗效。 目前，肿瘤的基因治疗主要选择恶性程度高、其它方法难以治疗的肿瘤作为研究对象，如恶性脑胶质瘤、黑色素瘤、肾母细胞瘤、肝癌、肺癌、胃癌和白血病等。大多数研究还只是处在临床或即将进入临床试验阶段，许多问题还有待于进一步的研究，这其中既有研究和应用的技术问题，也有大量的安全性问题和伦理学问题。
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