壳聚糖对观赏鱼体色影响和促生长作用的初步研究
一、目的意义：
　　观赏鱼体色鲜艳亮丽，赏心悦目。随着社会经济发展和人民生活水平的提高，越来越多的人喜欢观赏鱼，而世界交通运输的便利使观赏鱼市场得到进一步的开拓与发展。饲养观赏鱼不仅可以观赏、保健、科研及用于科普教育，而且还可以出口创汇，据统计，在1995年时世界出口量已达13571吨，中国出口仅460吨，占3.4％，1999年我国出口金额232.2万美元，因此，观赏鱼市场的开发前景广阔，市场巨大。
　　就观赏鱼的商品价值而言，其中一个非常重要的指标在于鱼体的色彩，一旦失去鲜艳的颜色，就会影响欣赏价值。然而在养殖条件下，一些观赏鱼的体色与自然状态下生活的同种个体有明显差异，主要表现在颜色减退，部分漂亮的条纹消失。这是由于生活环境改变，造成机体免疫力下降等一系列生理变化，影响色素沉着， 使养殖观赏鱼出现这种体色变异。如何使观赏鱼在人工养殖过程中保持其鲜艳的体色，是目前观赏鱼养殖中的一大难题。世界上许多国家，尤其是出口量较大的亚洲国家均在寻求解决的方法，至今仍未有效解决。
　　甲壳质是一种天然高分子聚合物，属于氨基多糖，学名为：N—乙酰—2—氨基—2—脱氧—D—葡萄糖，分子式为（C8H13NO5）n，单位体之间是以b（1—4）糖苷键连接，分子结构见上图。甲壳质主要存在于虾、蟹等节肢动物的外壳中，昆虫的外骨骼，内角质层，也存在于某些低等植物（如真菌、藻类）的细胞壁中，资源极其丰富，是仅次于纤维素的第二大自然资源。由于它的特殊分子结构和物理、化学性质，使它具有多种特殊生物学活性。壳聚糖是甲壳质在碱性溶液中脱乙酰基后得到的一种氨基多糖。近年来国际上对甲壳质、壳聚糖的研究十分活跃，取得了多种应用成果：壳聚糖具有广谱抗菌性，而且对人体无毒无副作用，可以增强机体的免疫调节功能， 具有很强的清除自由基即抗氧化活性等。
　　基于壳聚糖的生物学功能与鱼的色素沉积和健康状况息息相关，且壳聚糖在观赏鱼的色素沉淀、提高健康水平和促生长方面的作用目前还未见有报道，本文选择了壳聚糖对观赏鱼体色和促生长（体重）的作用进行了初步研究，以促进观赏鱼的养殖和市场需求，并希望通过这一研究缩短我国在这一领域与国外的差距。
二、仪器设备、试剂与原料：
　　仪器设备：玻璃养鱼缸、加热棒、加氧泵、EKDGJ１.25型小型饵料机、HW.SY11-K4C型恒温水浴锅、NJ-9型粘度仪、DHG-9030A型烘干箱、赛多利斯（Sartorius）BS110S型电子天平、722型分光光度计、JSM-2000CX型电子显微镜、各类玻璃器皿等。
　　试剂与原料：胡萝卜素标准品，丙酮，石油醚，均为分析纯。盐酸，氢氧化钠，高锰酸钾，亚硫酸钠均为化学纯。壳聚糖自制，粗蛋白，粗纤维，酵母粉、紫菜、氨基酸，维生素，特殊矿物质，甜菜碱，面粉和羧甲基纤维素钠作为制备饵料的原料。
三、实验内容与实验方案：
本项研究实验内容有5部分：
１、壳聚糖的制备
２、 含壳聚糖饵料的制备
３、 观赏鱼养殖试验，有两个内容：探索性试验，目的是掌握养鱼的要领，探索检验体色和测量促生长的方法正式试验，设三组处理，一组对照，定期观察、取样测定。
４、 鱼体胡萝卜素含量和体重观测，制定胡萝卜素标准吸光值曲线
５、 电镜观察鱼的色素细胞生长情况
四、实验方法与过程
1、 壳聚糖的制备
　　制备甲壳质的原料为废弃物虾、蟹壳，约含有20%左右的甲壳质，还含有大量的矿物质、蛋白质、脂肪、色素及少量的P、Fe、I等元素。通过不同的工艺将这些物质分离、脱除。实验步骤如下：
　　1）取食用后的虾壳100g，先用自来水洗干净，放于一容器内。
　　2）脱蛋白、脂肪工艺：在盛有洗净的虾壳容器中，加入5％的氢氧化钠溶液600ml，用玻璃棒搅匀后置于85℃的水浴锅中保温4小时，此时蛋白质溶于热碱液中，油脂则反应成为脂肪酸钠易被除去。滤去碱液，用自来水冲洗两遍，再用蒸馏水洗至中性。
　　3）脱矿物质工艺：虾壳中含有30—40％的碳酸钙等矿物质，用10％的盐酸溶液，在常温下浸泡已脱蛋白上述虾壳4小时，水洗至中性。
　　4）脱色工艺：主要是脱出虾壳中的虾青素，在容器中加入1％的高锰酸钾溶液，浸泡虾壳2小时，以氧化虾青素为无色。但高锰酸钾生成黑色二氧化锰附着虾壳体上，此时应滤去高锰酸钾溶液，然后加入2％的NaHS03溶液，在室温下浸泡虾壳，浸泡时可加入几滴盐酸，以使NaHS03在酸性条件下使二氧化锰还原为锰离子，从而达到脱色漂白的目的。水洗至中性。
　　5）干燥、粉碎：把湿甲壳质在60—70℃的条件下，干燥3～4小时。干燥后的甲壳质在粉碎机上粉碎，过80目筛，即为成品甲壳质。
　　称取上述甲壳质20g，放在烧杯内，加入50％左右的NaOH溶液200ml，放入恒温水浴锅中，85℃保温7小时。滤去碱液，再次加入50％的NaOH200ml，再次保温6小时。滤去碱液，清洗至中性，烘干称重得壳聚糖约12g。
2、含壳聚糖饵料的制备
　　将粗蛋白、粗纤维、壳聚糖（脱乙酰度为85％，分子量为76万）、酵母粉、紫菜、氨基酸、特殊矿物质、甜菜碱按比例混合待用，然后将面粉和羧甲基纤维素钠粘合剂用温开水或文火调成厚浆状，再将上述混合物慢慢掺入拌合，经饵料机制成象蒸松糕样的颗粒即成，烘干备用。
3、观赏鱼养殖试验
　　1）、预试验
　　自2003.5.31日起进行探索性预试验，目的: 熟悉仪器使用，熟练养殖的操作,探索检测观赏鱼体色的指标和测量体重的训练。购买0.8龄左右的丹顶（Carassius oranda）60条饲养，间隔一段时间后，测量体重和鱼体胡萝卜素的吸光值，记录在表1。
　　表1:探索性试验结果：
　　　　　　日期 总重量（g） 平均体重（g） 吸光度
　　　　　　5.31 14.361 3.590 0.708、0.710、0.711
　　　　　　6.14 15.012 3.753 0.971、0.975、0.977
　　　　　　6.21 15.447 3.862 1.159、1.164、1.163
　　2）、正式试验
　　以0.8龄左右的丹顶（Carassius oranda）为试验对象，购丹顶200尾（雌雄鱼各半），经暂养12天后平均分成四组放养于65×35×40㎝3的带有恒温的玻璃水箱中，按金鱼的养殖方法进行养殖和管理。设1组对照组，3组处理组，处理组投喂加有不同壳聚糖浓度的饵料（处理组1为对照组饲料＋1％壳聚糖；处理组2为对照组饲料＋2％壳聚糖；处理组3为对照组饲料＋5％壳聚糖），每天早十点喂养一次，以12天为一个试验周期。
4、鱼体胡萝卜素含量和体重观测
 　　每一周期末在喂前随机取出雌雄各4尾，处死，用精密天平测量观赏鱼平均体重变化（见表4），以此指标判断促生长情况；然后捣碎、用1：1乙醇－丙酮溶液萃取分离胡萝卜素，用722型分光光度计，在450nm波长下分别测定雌雄鱼所沉积的胡萝卜素吸光度，以此来表示体色的变化，并通过“吸光度－胡萝卜素”标准曲线方程计算出所含胡萝卜素的量，再换算为每100克鱼体所胡萝卜素．
　　表2：胡萝卜素含量与吸光值的关系
　　　　　　胡萝卜素（mg/100ml） 1 2 4 8 16 32
　　　　　　吸光度 1.290 1.440 1.651 2.092 2.831 4.210
5、观赏鱼色素细胞的电镜观察